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[求救] ChIP 轉錄因子negative和positive primer

看板Biotech (生命科學)作者 (黃金騎士 牙狼)時間5年前 (2019/11/19 11:21), 5年前編輯推噓0(0推 0噓 36→)
留言36則, 3人參與, 5年前最新討論串1/1
我現在要做ChIP-qPCR確認治療前後轉錄因子bind的目標promoter是否有增加 抗體(SP1和STAT3)都準備好了是CST ChIP等級的抗體 陰性對照的IgG抗體和磁珠beads也準備好了 預測promoter也從目標gene的上游2000 base估了3到4組primer 書上說最好要有轉錄因子negative control locus和positive control locus的primer 查了一下可以從文獻上面找(但查了半天查不到 人類乳癌細胞MDA231 SP1和STAT3) 有出ChIP Kit的也會附primer 但沒有要買的打算 商品也查不到序列 另外有人是從ENCODE從別人做過的ChIP-seq 找高表現和無表現的序列當positive或negative 但是ENCODE的介面實在看不太懂 細胞種類也不完全吻合 不知道有沒有人能教我怎麼設計SP1和STAT3用的negative和positive primer 還是說已經用了ChIP等級的抗體就不需要這些primer了? 已經卡了好幾天了 希望能得到幫忙 感激不盡 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 133.87.71.225 (日本) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1574133690.A.9D5.html ※ 編輯: hachibuya (133.87.71.225 日本), 11/19/2019 11:22:58
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11/19 12:32, 5年前 , 1F
你想kit附的primer會是以細胞種類吻合與否當前提嗎
11/19 12:32, 1F
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11/19 18:05, 5年前 , 2F
[s]直接做ChIP-seq吧！[/s]
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11/19 18:06, 5年前 , 3F
不過你ENCODE介面看不懂，ChIP-seq可能也看不懂怎麼分
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11/19 18:07, 5年前 , 4F
析？就算看得懂ENCODE並找到幾個乳癌細胞株都有SP1、
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11/19 18:08, 5年前 , 5F
STAT3 binding的位置，你還是需要設計3~5對不同peak位
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11/19 18:09, 5年前 , 6F
置的primer做positive control，以免ChIP有成功卻因為
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11/19 18:09, 5年前 , 7F
選定的positive位置出問題沒訊號而誤以為ChIP失敗
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11/19 21:46, 5年前 , 8F
感謝回覆 現在努力研究ENCODE中 謝謝
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11/20 01:00, 5年前 , 9F
你不一定要找ENCODE上有資料的基因當positive，STAT3很
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11/20 01:01, 5年前 , 10F
多研究已經有找出它的下游基因了，從這些下游基因裡挑
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11/20 01:02, 5年前 , 11F
幾個設計primer，做一組ChIP w/wo STAT3 antibody，只
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11/20 01:03, 5年前 , 12F
要設計的primer在STAT3 ChIP的樣本有訊號而NC ChIP中沒
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11/20 01:04, 5年前 , 13F
訊號或訊號超級弱，就能拿它當 positive。SP1更是一個
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11/20 01:05, 5年前 , 14F
到處都會binding的TF，要找到它的target gene很容易，
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11/20 01:05, 5年前 , 15F
negative的primer我就比較不清楚了，不確定是要找targe
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11/20 01:06, 5年前 , 16F
site隔個5~10 kbp的位置還是要找已知不會被這些TFs
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11/20 01:07, 5年前 , 17F
binding但是在你的細胞株中有表現的基因？
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11/20 01:16, 5年前 , 18F
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上面的連結，點Documents，裡面有一些NC primer可以設
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11/20 01:18, 5年前 , 20F
計的參考位置，它沒有給primer sequence(畢竟要賣)，但
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11/20 01:18, 5年前 , 21F
能從那個區域去設計你的NC primer，我找了下，其實這些
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11/20 01:21, 5年前 , 22F
資訊很容易找，你應該是要培養找到這些資料的能力的。
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11/20 01:23, 5年前 , 23F
順便告訴你一件事吧，TFs不一定binding的位置是在
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11/20 01:24, 5年前 , 24F
promoter，除非你本來就知道或已經有人證明過會binding
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11/20 01:24, 5年前 , 25F
在那裡，否則直接用promoter上游幾kb當做target是有可
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11/20 01:25, 5年前 , 26F
能做不出來的，甚至binding其實是在超級遠的enhancer上
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11/20 01:26, 5年前 , 27F
，這種情況除非你ChIP做得非常好，不然從promoter設計
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11/20 01:26, 5年前 , 28F
primer都是有風險的，雖然有些人認為這風險可以忽略...
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11/20 09:30, 5年前 , 29F
xxtomnyxx感謝您願意分享那麼多知識給我,後來我和老師
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11/20 09:31, 5年前 , 30F
討論,雖然他也沒有做過ChIP,不過他認為有用IgG做陰性
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11/20 09:32, 5年前 , 31F
抗體的話應該就可以當作negative control,不過從您給的
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11/20 09:32, 5年前 , 32F
連結,我會試著從上面寫的Gene desert上設計看看,另外
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11/20 09:33, 5年前 , 33F
關於binding site,我現在試著從ENCODE上別人做過的ChIP
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11/20 09:34, 5年前 , 34F
seq上找看看,我想看的基因確實在上游附近有滿高倍的表
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11/20 09:35, 5年前 , 35F
我會從這些區域100bp前後設計primer,再加上電腦模擬的
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11/20 09:36, 5年前 , 36F
幾個binding site去設計primer,看做不做得出來 謝謝您
11/20 09:36, 36F
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