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[求救] 某個質體一濃縮就沈澱

看板Biotech (生命科學)作者 (不存在的騎士)時間4年前 (2020/02/03 18:05), 4年前編輯推噓7(7推 0噓 51→)
留言58則, 10人參與, 4年前最新討論串1/1
大家好，我最近在製備送定序用的質體，這個質體約20000 bps，分別以NautiaZ 和GeneMark的kit萃取過，並且最終以純水溶出。但在進一步濃縮的時候遭遇到如下的 狀況： 1. 以帶抽氣和離心功能的濃縮機濃縮時，會在20分鐘內產生白色沈澱，根據測試加熱、 振動、pipetting都無法溶化此沈澱；此現象已被多次再現過 2. 以乾浴槽濃縮時偶會產生沈澱，其發生條件未清楚測試 3. 發生該沈澱之後的溶液仍能以Nanodrop測得DNA，且其濃度隨濃縮增加，但在此同 時，以電泳測試該DNA水溶液會發現偵測到的band在變淡 4. 將已產生該沈澱的DNA溶液丟進Phenol:Choloroform以傳統法跑一遍，產物會直接帶 有沈澱（無法完全溶於水中） 5. 一開始就以傳統法萃取的同一質體不會發生以上現象 6. 雖然遭遇此現象之後並未做過測試比對，不過這是目前本實驗室在濃縮操作中唯一 發生這些狀況的DNA 目前我暫且將乾浴濃縮中沒有發生沈澱的DNA收集起來，成功獲得了足夠送定序的 量，但仍然希望能解開這個謎團（不然我過去半個月花掉的時間就沒有任何價值了）。 不知道有沒有人看過類似的實例，請大家指教。謝謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.209.235 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1580724305.A.03C.html
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02/03 19:55, 4年前 , 1F
kit有附Elution buffer，為什麼要用水？
02/03 19:55, 1F
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02/03 20:02, 4年前 , 2F
按照我的經驗，菌養濃一點，按照kit的protocol操作完，
02/03 20:02, 2F
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02/03 20:02, 4年前 , 3F
即可送定序，抽出來濃度都有200ng/ul以上。除非有特殊
02/03 20:02, 3F
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02/03 20:02, 4年前 , 4F
需求，不然好像沒有你操作的那麼複雜，都是隨意抽
02/03 20:02, 4F
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02/03 21:55, 4年前 , 5F
該定序單位要求用純水回溶，然後很長的DNA用column回
02/03 21:55, 5F
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02/03 21:55, 4年前 , 6F
收率會下降（卡在column上下不來），加上這個質體是
02/03 21:55, 6F
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02/03 21:55, 4年前 , 7F
low copy number，單純用mini kit照protocol抽出來大
02/03 21:55, 7F
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02/03 21:56, 4年前 , 8F
約都會低於40ng/microliter。
02/03 21:56, 8F
推
02/03 22:22, 4年前 , 9F
個人覺得是protein crap吧
02/03 22:22, 9F
其實我自己至今還是不時懷疑這是不是蛋白質，不過除了前述現象以外，還有以 下理由不支持這個假設： 1. Kit本來就不太容易抽出明顯的蛋白質汙染，而在十次以上的萃取中獲得的所有拿 來濃縮的樣本都能再現相同的大量蛋白質汙染可能性太低了。 2. 樣本（濃縮前和濃縮後）過Nanodrop的260/280數值大部分都落在1.4~1.8，且無論 高低，即使拿那一小部分2.0的樣本去濃縮一樣會發生沉澱。
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02/04 10:58, 4年前 , 10F
有的廠商能用菌液定序，也許可以試試
02/04 10:58, 10F
我們之前用的廠商接受菌液菌盤，但這系列實驗送了幾次都收到短且不穩定的結 果，和該公司諸如「由於抽出質體濃度低，我們將再次培養後...」、「由於抽出質體 濃度低，我們將不再做...」之類的來信。實驗室後來就決定這個質體將來都改用另一 家定序，根據經驗定序結果比較長且穩定，但會要你自己製備並濃縮好DNA。 這種情況其實滿常發生的；我們覺得接受菌的廠商可能也就是養出來用kit抽之後 直接定序，只要不是一樓說的那種好抽的質體就不會有太漂亮的結果。 ※ 編輯: hermitwhite (1.168.83.14 臺灣), 02/04/2020 14:16:26
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02/05 05:14, 4年前 , 11F
要說濃縮質體我會用的方法是酒精沈澱再用少量水回溶，
02/05 05:14, 11F
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02/05 05:14, 4年前 , 12F
倒是沒試過低溫乾燥
02/05 05:14, 12F
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02/05 16:33, 4年前 , 13F
沉澱前後的samples拿去跑膠,分子量一樣嗎？
02/05 16:33, 13F
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02/06 21:27, 4年前 , 14F
分子量一樣，且沒有觀察到明顯的smear。
02/06 21:27, 14F
推
02/07 07:19, 4年前 , 15F
有nanodrop的spectrum嗎？有的話把kit跟pci抽的都丟上
02/07 07:19, 15F
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02/07 07:19, 4年前 , 16F
來大家看看
02/07 07:19, 16F
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02/07 21:18, 4年前 , 17F
中間還要繼續定序，之後抽的時候我留一下。
02/07 21:18, 17F
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02/07 23:34, 4年前 , 18F
mini kit或許可以換一家試試看?
02/07 23:34, 18F
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02/07 23:49, 4年前 , 19F
拍謝沒有看到想探討此現象的原因
02/07 23:49, 19F
推
02/10 22:31, 4年前 , 20F
好奇最後你有定序成功嗎？你的plasmid有20k,是否有跟廠
02/10 22:31, 20F
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02/10 22:31, 4年前 , 21F
商說？
02/10 22:31, 21F
推
02/10 22:37, 4年前 , 22F
不建議你用乾燥的方式濃縮，抽出的的plasmid,多少都有鹽
02/10 22:37, 22F
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02/10 22:37, 4年前 , 23F
類跟蛋白殘留，你用抽乾的方式會提高鹽類濃度，不利後
02/10 22:37, 23F
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02/10 22:37, 4年前 , 24F
序定序。
02/10 22:37, 24F
推
02/10 22:40, 4年前 , 25F
20k 的plasmid 你如果沒先說，沒換條件做，保證做不出
02/10 22:40, 25F
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02/10 22:40, 4年前 , 26F
來的。
02/10 22:40, 26F
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02/20 01:30, 4年前 , 27F
累積多次定序有慢慢定出來了，就是濃縮很花時間，然
02/20 01:30, 27F
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02/20 01:30, 4年前 , 28F
後kit很貴。這些送定序樣本的資訊我們都有給。
02/20 01:30, 28F
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02/20 01:32, 4年前 , 29F
現在這個定序單位對20k plasmid送定序建議的濃度是
02/20 01:32, 29F
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02/20 01:34, 4年前 , 30F
500ng/microliter，不濃縮也根本不知道怎麼生出來。
02/20 01:34, 30F
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02/20 01:35, 4年前 , 31F
雖然後來還是濃縮到200ng/microliter就送了。
02/20 01:35, 31F
※ 編輯: hermitwhite (125.230.16.105 臺灣), 02/20/2020 02:29:25
推
02/24 08:36, 4年前 , 32F
是用Terrific Broth養嗎？
02/24 08:36, 32F
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02/26 13:01, 4年前 , 33F
好像是Miller's LB broth。
02/26 13:01, 33F
感謝大家的建議。我這陣子又做了一些測試，以下是後來確認的事： 1. 從DH5α和BW25113裡萃取出的同一個質體都有此現象 2. 同系列其他質體沒有發生相同現象，例如說我這個質體是pGETS118+A+B，而 pGETS118+A溶液濃縮不會產生沉澱，長度更長的pGETS118+A+C溶液濃縮也不 會產生沉澱；目前正在試著在後面接其他東西看看 然後以下是幾個樣本的Nanodrop spectrum，因為只是順便紀錄的所以參數 的對照性沒很好。 樣本1. Kit 回收，50 microliter https://imgur.com/n3bLPnc
在乾浴槽中70℃烘乾20分鐘後，產生少量白色沉澱 https://imgur.com/uYKFa9B
樣本2. Kit 回收，50 microliter https://imgur.com/8Ok4J35
在乾浴槽中70℃烘乾20分鐘後，產生少量白色沉澱 https://imgur.com/77Ihd8M
樣本3. Kit 回收，150 microliter https://imgur.com/GNrlSFo
在減壓濃縮機中60℃烘乾20分鐘後，產生較大量白色沉澱 https://imgur.com/xeXmWWw
樣本4. Kit 回收，150 microliter https://imgur.com/WpRR6r9
在減壓濃縮機中60℃烘乾20分鐘後，產生較大量白色沉澱 https://imgur.com/F9Q9cIC
樣本5. 傳統法回收 已回溶後又減壓濃縮了30分鐘以上；未觀察到沉澱 https://imgur.com/OSIEatG
※ 編輯: hermitwhite (1.168.75.50 臺灣), 02/26/2020 13:26:51
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02/26 14:07, 4年前 , 34F
你給的260/280結果跟kit的比很糟,顯示根本不適合傳統回收
02/26 14:07, 34F
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02/26 14:13, 4年前 , 35F
你應該調整kit的使用,對於low copy,就使用平5~10x的菌量,
02/26 14:13, 35F
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02/26 14:14, 4年前 , 36F
solution I~III也配合調整到2~3X的用量,以達到完全lyse
02/26 14:14, 36F
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02/26 14:23, 4年前 , 37F
而要純化時,則是把上面放大的體積分次"只"過同一個column
02/26 14:23, 37F
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02/26 14:26, 4年前 , 38F
這樣就算是low copy,也可以達到一般的濃度
02/26 14:26, 38F
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02/26 14:31, 4年前 , 39F
還有,對於你提到kit很貴這件事我也存疑,一個mini-prep再怎
02/26 14:31, 39F
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02/26 14:34, 4年前 , 40F
麼貴,也不會超過一個定序的價格,plasmid好好確認品質再送
02/26 14:34, 40F
這個質體的問題不只是low copy number，也包括了質體大回收率低。先前 我們使用midi kit一次抽70mL，單次回溶也最多能回收到60ng/microliter左右 （但前陣子廠商無法供應midi kit所以就改用mini），因此多次溶出或溶出較 大體積後濃縮可能是不可避免的。還是說大質體回收率低這件事能藉由讓column 吸附到承載量上限來突破？ 另外kit很貴是把一次會使用四到八個unit算進去，不過這是順便一提，和 問題關係不大就是。 ※ 編輯: hermitwhite (1.168.75.50 臺灣), 02/26/2020 15:02:08
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02/26 17:08, 4年前 , 41F
既然你都知道是low copy了,怎麼會擔心超過cloumn acpacity
02/26 17:08, 41F
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02/26 17:21, 4年前 , 42F
一般mini cloumng上限大約20ug,然後low copy plasmid每ml
02/26 17:21, 42F
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02/26 17:24, 4年前 , 43F
約1ug,所以用10ml以上的pellet去過同一個cloumn綽綽有餘
02/26 17:24, 43F
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02/26 17:26, 4年前 , 44F
如果你是好幾個column去回收再濃縮,結果自然會很糟
02/26 17:26, 44F
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02/26 23:37, 4年前 , 45F
我這裡不是擔心超過capacity，我是問說你是不是覺得
02/26 23:37, 45F
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02/26 23:38, 4年前 , 46F
吸附到接近capacity能增加溶出量；看起來是？
02/26 23:38, 46F
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02/26 23:43, 4年前 , 47F
那理論上我換更薄的column來用也是一個辦法？
02/26 23:43, 47F
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02/27 00:04, 4年前 , 48F
當然不是！！
02/27 00:04, 48F
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02/27 00:07, 4年前 , 49F
low copy意味同體積的菌液可能只有平常1/10 plasmid
02/27 00:07, 49F
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02/27 00:07, 4年前 , 50F
->用平常的體積會導致只有1/10的濃度->濃度低,OD也極不準
02/27 00:07, 50F
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02/27 00:10, 4年前 , 51F
->但要是配合用1/10體積的水,則elute的效率會極差
02/27 00:10, 51F
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02/27 00:12, 4年前 , 52F
所以藉由增加plasmid input過cloumn的手段,才能兼顧效率
02/27 00:12, 52F
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02/27 00:14, 4年前 , 53F
cloumn的厚薄跟capacity有關,量都不夠了,用薄的不就更怪
02/27 00:14, 53F
推
02/29 23:55, 4年前 , 54F
要不要用Terrific Broth養看看？應該會長多一些
02/29 23:55, 54F
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03/21 16:51, 4年前 , 55F
感謝，之前不知道Terrific Broth的功能，最近才偶然
03/21 16:51, 55F
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03/21 16:51, 4年前 , 56F
看到能增加質體，之後有類似需求會試試看。還有這個
03/21 16:51, 56F
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03/21 16:53, 4年前 , 57F
質體現在我都PCR之後送產物去定序了，產量和定序的穩
03/21 16:53, 57F
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03/21 16:54, 4年前 , 58F
定性都明顯有比較好。
03/21 16:54, 58F
※ 編輯: hermitwhite (36.234.7.166 臺灣), 03/21/2020 16:54:46
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