[求救] 某個質體一濃縮就沈澱
大家好,我最近在製備送定序用的質體,這個質體約20000 bps,分別以NautiaZ
和GeneMark的kit萃取過,並且最終以純水溶出。但在進一步濃縮的時候遭遇到如下的
狀況:
1. 以帶抽氣和離心功能的濃縮機濃縮時,會在20分鐘內產生白色沈澱,根據測試加熱、
振動、pipetting都無法溶化此沈澱;此現象已被多次再現過
2. 以乾浴槽濃縮時偶會產生沈澱,其發生條件未清楚測試
3. 發生該沈澱之後的溶液仍能以Nanodrop測得DNA,且其濃度隨濃縮增加,但在此同
時,以電泳測試該DNA水溶液會發現偵測到的band在變淡
4. 將已產生該沈澱的DNA溶液丟進Phenol:Choloroform以傳統法跑一遍,產物會直接帶
有沈澱(無法完全溶於水中)
5. 一開始就以傳統法萃取的同一質體不會發生以上現象
6. 雖然遭遇此現象之後並未做過測試比對,不過這是目前本實驗室在濃縮操作中唯一
發生這些狀況的DNA
目前我暫且將乾浴濃縮中沒有發生沈澱的DNA收集起來,成功獲得了足夠送定序的
量,但仍然希望能解開這個謎團(不然我過去半個月花掉的時間就沒有任何價值了)。
不知道有沒有人看過類似的實例,請大家指教。謝謝。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.209.235 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1580724305.A.03C.html
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其實我自己至今還是不時懷疑這是不是蛋白質,不過除了前述現象以外,還有以
下理由不支持這個假設:
1. Kit本來就不太容易抽出明顯的蛋白質汙染,而在十次以上的萃取中獲得的所有拿
來濃縮的樣本都能再現相同的大量蛋白質汙染可能性太低了。
2. 樣本(濃縮前和濃縮後)過Nanodrop的260/280數值大部分都落在1.4~1.8,且無論
高低,即使拿那一小部分2.0的樣本去濃縮一樣會發生沉澱。
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我們之前用的廠商接受菌液菌盤,但這系列實驗送了幾次都收到短且不穩定的結
果,和該公司諸如「由於抽出質體濃度低,我們將再次培養後...」、「由於抽出質體
濃度低,我們將不再做...」之類的來信。實驗室後來就決定這個質體將來都改用另一
家定序,根據經驗定序結果比較長且穩定,但會要你自己製備並濃縮好DNA。
這種情況其實滿常發生的;我們覺得接受菌的廠商可能也就是養出來用kit抽之後
直接定序,只要不是一樓說的那種好抽的質體就不會有太漂亮的結果。
※ 編輯: hermitwhite (1.168.83.14 臺灣), 02/04/2020 14:16:26
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感謝大家的建議。我這陣子又做了一些測試,以下是後來確認的事:
1. 從DH5α和BW25113裡萃取出的同一個質體都有此現象
2. 同系列其他質體沒有發生相同現象,例如說我這個質體是pGETS118+A+B,而
pGETS118+A溶液濃縮不會產生沉澱,長度更長的pGETS118+A+C溶液濃縮也不
會產生沉澱;目前正在試著在後面接其他東西看看
然後以下是幾個樣本的Nanodrop spectrum,因為只是順便紀錄的所以參數
的對照性沒很好。
樣本1. Kit 回收,50 microliter
https://imgur.com/n3bLPnc
在乾浴槽中70℃烘乾20分鐘後,產生少量白色沉澱
https://imgur.com/uYKFa9B
樣本2. Kit 回收,50 microliter
https://imgur.com/8Ok4J35
在乾浴槽中70℃烘乾20分鐘後,產生少量白色沉澱
https://imgur.com/77Ihd8M
樣本3. Kit 回收,150 microliter
https://imgur.com/GNrlSFo
在減壓濃縮機中60℃烘乾20分鐘後,產生較大量白色沉澱
https://imgur.com/xeXmWWw
樣本4. Kit 回收,150 microliter
https://imgur.com/WpRR6r9
在減壓濃縮機中60℃烘乾20分鐘後,產生較大量白色沉澱
https://imgur.com/F9Q9cIC
樣本5. 傳統法回收
已回溶後又減壓濃縮了30分鐘以上;未觀察到沉澱
https://imgur.com/OSIEatG
※ 編輯: hermitwhite (1.168.75.50 臺灣), 02/26/2020 13:26:51
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這個質體的問題不只是low copy number,也包括了質體大回收率低。先前
我們使用midi kit一次抽70mL,單次回溶也最多能回收到60ng/microliter左右
(但前陣子廠商無法供應midi kit所以就改用mini),因此多次溶出或溶出較
大體積後濃縮可能是不可避免的。還是說大質體回收率低這件事能藉由讓column
吸附到承載量上限來突破?
另外kit很貴是把一次會使用四到八個unit算進去,不過這是順便一提,和
問題關係不大就是。
※ 編輯: hermitwhite (1.168.75.50 臺灣), 02/26/2020 15:02:08
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※ 編輯: hermitwhite (36.234.7.166 臺灣), 03/21/2020 16:54:46
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