[求救] polyadenylation troubleshooting

看板Biotech (生命科學)作者kaofei (phoebe)時間4年前 (2020/03/25 21:40)推噓0(0推 0噓 0→)

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版上大大好，最近做實驗撞牆想請大家幫忙troubleshooting orz 我要幫一個正向單股RNA病毒定全長genome，所以在做RACE 這個病毒沒有poly(A) tail，參考文獻後決定抽完RNA後加上poly(A)再用oligo dT轉cDNA 病毒來源是細胞加上清液一同冷凍解凍後的混合液抽RNA的kit是QIAamp viral RNA kit，最後用AVE回溶 polyadenylation 是用 thermo 的Poly(A) tailing kit (AM1350) 因為我只是要做3'RACE (Roche)，RNA不用太多，所以我把reaction volume降至25 ul PCR的部分是用taq系列以gene-specific forward搭配dT後接的anchor primer來p 第一次操作很順利，3'RACE有成功做出來，但之後操作不同毒株就一直失敗... 我做了一些測試，感覺是cDNA沒轉出來因為拿接近3'end的reverse primer搭配成功的forward primer沒辦法p出產物（確認可用）我有幾個點想請教大家的意見第一是我發現加完A tail的reaction mix裡會有白色的沈澱，有人知道這是什麼嗎＠＠第二是因為RNA有細胞跟病毒的部分，run gel看是否有加上A tail似乎不實際？不知是否有其他方式能幫助評估 A tailing是否成功第三是關於kit內有ATP solution，protocol有註明其對溫度很敏感我基本上都在冰上操作，只有解凍的時候會因為彈tube或spin down離開冰上但我有可能是我第一次操作完ATP solution就失效嗎＠＠第一次碰這個kit 成功來得突然，失敗出現得太快orz 以上問題，還希望版上大大幫忙解惑，謝謝！！！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 219.91.53.158 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1585143624.A.660.html