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[求救] Western 條帶反白

看板Biotech (生命科學)作者 (悠悠)時間4年前 (2020/05/13 16:13), 編輯推噓8(8推 0噓 17→)
留言25則, 10人參與, 4年前最新討論串1/1
代PO 一開始使用1:500濃度的的一抗，曝光時間一分鐘，出來是有東西的 https://i.imgur.com/pOJQykG.png
後來新的一批細胞收下來之後(實驗條件全部相同)，曝光時間才2秒就變這樣QQ，目標蛋 白直接變成白色的，其他分子量的蛋白也是全部反白了 https://i.imgur.com/04djSL0.png
之後在想是不是抗體濃度太高，調整到1:2000，結果還是一樣全部反白 https://i.imgur.com/qdF2hv7.png
實驗條件 蛋白濃度:20mg/ml 垂直式電泳電壓70~120V跑到看到蛋白在底部 Transfer(全濕式)用400mA轉90分鐘，有確定看到prestained marker在膜上 Blocking(5%脫脂奶粉)30分鐘 一抗:用過1:500,1:1000,現在是用1:2000 冰箱搖overnight PBST wash30分鐘，每10分鐘換一次 二抗:1:1000室溫搖1hr PBST wash 30分鐘，每10分鐘換一次 用機器壓片，沾ECL，曝光時間從最短1/8秒一路增加到最多2分鐘 想請問各位大大有遇過一直反白的情形嗎，壓不出正常黑色的BAND了 請問這種情況該怎麼解決呢 ? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.251.192.113 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1589357588.A.E2A.html
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05/13 18:21, 4年前 , 1F
片子外面是白色的，機器設定反白?
05/13 18:21, 1F
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05/13 20:29, 4年前 , 2F
調一下機器設定吧，會不會剛好設定跑掉了沒注意到
05/13 20:29, 2F
推
05/13 20:34, 4年前 , 3F
軟體設定問題, 自己反相就好了
05/13 20:34, 3F
推
05/13 21:52, 4年前 , 4F
壓片是指底片嗎? 之前遇過二抗太強，壓底片band反白
05/13 21:52, 4F
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05/16 08:42, 4年前 , 5F
壓tubulin是黑的沒問題，應該不是機器設定的問題
05/16 08:42, 5F
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05/16 08:47, 4年前 , 6F
更正：不是壓片，是直接把membrane沾好ECL放入機器裡面
05/16 08:47, 6F
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05/16 08:47, 4年前 , 7F
調曝光時間然後讓他顯影
05/16 08:47, 7F
推
05/16 12:34, 4年前 , 8F
可以稀釋ECL試試看 有時候是band燒掉反白
05/16 12:34, 8F
推
05/16 18:37, 4年前 , 9F
感覺像燒掉了
05/16 18:37, 9F
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05/17 00:55, 4年前 , 10F
那請問會跟曝光時間有關嗎，還是單純是ECL濃度問題
05/17 00:55, 10F
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05/17 00:55, 4年前 , 11F
有試過減短曝光時間，但不是沒東西就是燒掉
05/17 00:55, 11F
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05/17 00:55, 4年前 , 12F
我會試試看減少ECL濃度的！感謝
05/17 00:55, 12F
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05/17 18:39, 4年前 , 13F
二抗的濃度也可以再調整看看，覺得1:1000有點高
05/17 18:39, 13F
推
05/18 16:30, 4年前 , 14F
背景全黑也滿妙的 通常二抗沒濃到10倍不會這樣
05/18 16:30, 14F
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05/18 19:13, 4年前 , 15F
因為想確認有無東西，拉長曝光時間，然後背景就變黑，蛋
05/18 19:13, 15F
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05/18 19:13, 4年前 , 16F
白的位置則是反白QQ
05/18 19:13, 16F
推
05/18 20:11, 4年前 , 17F
奶粉ok嗎？其他人/抗體也壓成這樣？
05/18 20:11, 17F
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05/18 22:43, 4年前 , 18F
05/18 22:43, 18F
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05/18 22:43, 4年前 , 19F
同一片的tubulin是正常的,所以判斷應該不是blocking問題
05/18 22:43, 19F
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05/19 16:53, 4年前 , 20F
二抗太強了，1:10000很足夠了......
05/19 16:53, 20F
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05/19 18:15, 4年前 , 21F
跑了一二抗都1:10000的
05/19 18:15, 21F
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05/19 18:15, 4年前 , 22F
結果，一樣的問題，不過最底部（分子量最小的地方有黑黑
05/19 18:15, 22F
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05/19 18:15, 4年前 , 23F
的band),真的很妙....
05/19 18:15, 23F
推
05/21 07:00, 4年前 , 24F
再稀釋 不然用bsa來block看看
05/21 07:00, 24F
推
08/28 01:43, 4年前 , 25F
黑色band是反相後的影像，亮band是原始影像..
08/28 01:43, 25F
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