PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] 質體設計是否有問題

看板Biotech (生命科學)作者 (opport)時間4年前 (2020/10/22 21:37), 4年前編輯推噓5(5推 0噓 41→)
留言46則, 9人參與, 4年前最新討論串1/2 (看更多)
因為構築好的質體之後要來產蛋白 但小弟是新手，不確定這樣設計是否會有什麼問題 1.會有其他雜band出現嗎？ 2.我的那段insert前面的T7 promoter因為離insert有點距離，所以我在設計insert的時 候， 前面加了start codon，這樣會有蛋白做不出來的問題嗎？ 3.圖中的insert大小是414bps，還有另外的是369bps，這樣在跑WB後，跑出來的結果是不 是會滿靠近的？ https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg
-- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.73.234.44 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1603373875.A.5CE.html ※ 編輯: nm768417 (42.73.234.44 臺灣), 10/22/2020 21:42:19 ※ 編輯: nm768417 (42.73.234.44 臺灣), 10/23/2020 01:56:32 ※ 編輯: nm768417 (42.73.234.44 臺灣), 10/23/2020 01:57:30
→
10/23 11:02, 4年前 , 1F
還是那句老話：問問題請把問題描述清楚。
10/23 11:02, 1F
→
10/23 11:02, 4年前 , 2F
1. 雜band？是做什麼實驗的？切 RE？PCR？WB？
10/23 11:02, 2F
→
10/23 11:02, 4年前 , 3F
2. 你給的圖上沒有T7 promoter(雖然我看的出來在哪裡)
10/23 11:02, 3F
→
10/23 11:02, 4年前 , 4F
，請你標記好。
10/23 11:02, 4F
→
10/23 11:02, 4年前 , 5F
3. 在問這個問題前，你有先去理解過WB的原理嗎？如果
10/23 11:02, 5F
→
10/23 11:02, 4年前 , 6F
有，請問你用什麼一抗？
10/23 11:02, 6F
推
10/23 11:02, 4年前 , 7F
你是有refolding相關需求才用pET32a? 若不是，你要想
10/23 11:02, 7F
→
10/23 11:02, 4年前 , 8F
想到時候你目標蛋白N段前面可是會多不少東西啊 （前面
10/23 11:02, 8F
→
10/23 11:02, 4年前 , 9F
已經有atg，你加不加都無所謂），到時候還要多一道切的
10/23 11:02, 9F
→
10/23 11:02, 4年前 , 10F
步驟
10/23 11:02, 10F
→
10/23 11:10, 4年前 , 11F
如果你希望insert獨立做出一個蛋白，那除了ATG以外還
10/23 11:10, 11F
→
10/23 11:10, 4年前 , 12F
要放Shine-Dalgarno sequence，而且還要放stop codon
10/23 11:10, 12F
→
10/23 11:10, 4年前 , 13F
終止前面TrxA蛋白的轉譯；如果你要做一個insert和TrxA
10/23 11:10, 13F
→
10/23 11:10, 4年前 , 14F
的fusion protein，那加不加ATG都無所謂。
10/23 11:10, 14F
→
10/23 11:44, 4年前 , 15F
感謝各位大神回覆，抱歉可能我問題沒有問的很清楚，我
10/23 11:44, 15F
→
10/23 11:44, 4年前 , 16F
的質體目的是想做出insert的獨立蛋白，進而表達出抗原然
10/23 11:44, 16F
→
10/23 11:44, 4年前 , 17F
後去偵測血清中的抗體，然後有看到回覆的留言，有看到要
10/23 11:44, 17F
→
10/23 11:44, 4年前 , 18F
加入shine-dalgarno sequence還有stop codon，我想請問
10/23 11:44, 18F
→
10/23 11:44, 4年前 , 19F
一下這個要怎麼加入到insert上，加上去的話的順序是stop
10/23 11:44, 19F
→
10/23 11:44, 4年前 , 20F
codon-酵素切位-shine-dalgarno sequence-AUG-insert
10/23 11:44, 20F
→
10/23 11:44, 4年前 , 21F
嗎，抱歉我是菜鳥大學生
10/23 11:44, 21F
→
10/23 16:36, 4年前 , 22F
等等，大學生？實驗室沒有前輩嗎？
10/23 16:36, 22F
→
10/23 17:51, 4年前 , 23F
實驗室沒有碩生跟博生也沒有助理
10/23 17:51, 23F
→
10/23 22:08, 4年前 , 24F
老闆放生嗎?這大概是碩班題目的難度?
10/23 22:08, 24F
推
10/24 00:09, 4年前 , 25F
等等沒有碩博也沒助理只有專題是怎樣囧
10/24 00:09, 25F
→
10/24 10:09, 4年前 , 26F
你要不要換實驗室比較快阿
10/24 10:09, 26F
→
10/24 10:11, 4年前 , 27F
expression vector基本設計問題實驗室沒人可教只能上網
10/24 10:11, 27F
→
10/24 10:11, 4年前 , 28F
問網友...
10/24 10:11, 28F
→
10/25 13:06, 4年前 , 29F
但還是想辦法解決下好了 是說 stop 跟 start codon
10/25 13:06, 29F
→
10/25 13:06, 4年前 , 30F
應該寫反了？
10/25 13:06, 30F
推
10/25 13:10, 4年前 , 31F
喔我看錯了, 你寫的應該是對的， insert尾巴還要再一
10/25 13:10, 31F
→
10/25 13:10, 4年前 , 32F
個stop。另外跑膠理論上只會有一個 band 但實際上要
10/25 13:10, 32F
→
10/25 13:10, 4年前 , 33F
跑了才知道
10/25 13:10, 33F
→
10/25 14:29, 4年前 , 34F
感謝樓上大神指導，那stop codon要怎麼加上去？因為是
10/25 14:29, 34F
→
10/25 14:29, 4年前 , 35F
酵素切然後黏上去vector上，這樣不是要加在6-his tag後
10/25 14:29, 35F
→
10/25 14:29, 4年前 , 36F
面嗎？
10/25 14:29, 36F
→
10/25 15:16, 4年前 , 37F
單就這個 vector 的設計和製做大概是大學專題生水準，
10/25 15:16, 37F
→
10/25 15:17, 4年前 , 38F
包含血清測試整套做完差不多就是碩班題目。你現在大幾
10/25 15:17, 38F
→
10/25 15:18, 4年前 , 39F
？原核生物的轉錄轉譯調控學過了嗎？知道 ORF 的 frame
10/25 15:18, 39F
→
10/25 15:19, 4年前 , 40F
是什麼嗎？知道你的程度比較方便告訴你要怎麼做。
10/25 15:19, 40F
推
10/25 20:02, 4年前 , 41F
5’-切位-start-你的基因-3’
10/25 20:02, 41F
→
10/25 20:02, 4年前 , 42F
5’-切位-stop-你的基因-3‘
10/25 20:02, 42F
→
10/25 21:03, 4年前 , 43F
問網友反饋花的時間比較長。試試找其他實驗室學長姐會比較
10/25 21:03, 43F
→
10/25 21:03, 4年前 , 44F
快。另外，現階段你需要那些背景知識也可以由他們協助。
10/25 21:03, 44F
推
10/31 14:44, 4年前 , 45F
良心建議既然實驗室放生你，就放生實驗室吧，把時間拿去
10/31 14:44, 45F
→
10/31 14:44, 4年前 , 46F
補充基本知識甚至精進英文也比在這間實驗室浪費時間好
10/31 14:44, 46F
‣ 更多 nm768417 的文章
文章代碼(AID): #1VaOipNE (Biotech)
討論串 (同標題文章)
以下文章回應了本文：
完整討論串 (本文為第 1 之 2 篇)：
排序： 最舊先 | 最新先 | 留言數
在新視窗開啟完整討論串 (共2篇)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 nm768417 的文章
文章代碼(AID): #1VaOipNE (Biotech)