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[求救] PBMCs上flow但抗體染不上去

看板Biotech (生命科學)作者 (桔)時間4年前 (2020/11/08 21:33), 4年前編輯推噓5(5推 0噓 30→)
留言35則, 10人參與, 4年前最新討論串1/1
各位大大好，我的實驗目前是從小鼠中分離出PBMCs然後染monocyte 上flow看細胞群比例 但是卡在無奈我怎麼染都染不出來！！ 問過學長姊以及別家實驗室的人、抗體重買新的、步驟條件也不敢亂改 但怎麼樣就是失敗 染色抗體為： BioLegend的PEcy7 anti-mouse CD11b 和Biotin anti-mouse Ly6c 皆在4度西反應30分鐘 Load抗體的時確認每個tip都有插入細胞液裡面 這是學姊的圖 https://i.imgur.com/7QyrY2o.jpg
這是我的圖 https://i.imgur.com/KwPEbdF.jpg
很明顯cd11b根本都沒染到！！但就是無解 請各位大大提供一些建議救救我TT -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.216.167.189 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1604842420.A.37C.html
推
11/09 02:15, 4年前 , 1F
感覺比較像population分不開，不是完全沒染到
11/09 02:15, 1F
推
11/09 02:19, 4年前 , 2F
有一部分的確有染到，所以偏右的地方APC-Cy7 hi和in
11/09 02:19, 2F
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11/09 02:19, 4年前 , 3F
t的兩群有出現，但就算你整框移過去比例也不會高到
11/09 02:19, 3F
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11/09 02:19, 4年前 , 4F
像你學姐一樣，因為有一部分是沒吃到染劑/和原本pop
11/09 02:19, 4F
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11/09 02:19, 4年前 , 5F
ulation沒分開，所以像被low expression的那群吃掉
11/09 02:19, 5F
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11/09 02:19, 4年前 , 6F
一部分成員
11/09 02:19, 6F
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11/09 02:22, 4年前 , 7F
應該也不是單純電壓和compensation 問題，因為分不
11/09 02:22, 7F
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11/09 02:22, 4年前 , 8F
開可以想像成是兩顆球重疊在一起，就算把外框拖移
11/09 02:22, 8F
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11/09 02:22, 4年前 , 9F
變形，重疊的部分也不會分開
11/09 02:22, 9F
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11/09 02:28, 4年前 , 10F
分不開時我成功過的方法只有重染、或改染色條件（
11/09 02:28, 10F
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11/09 02:28, 4年前 , 11F
像染色時的溫度）、換不同色的染劑（弱表現的抗原配
11/09 02:28, 11F
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11/09 02:28, 4年前 , 12F
強染劑），染色時間30分鐘應該夠長我覺的不用變（
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11/09 02:28, 4年前 , 13F
更長沒洗掉，在某些sample會high和int expression
11/09 02:28, 13F
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11/09 02:28, 4年前 , 14F
擠在一起，但Case by case)
11/09 02:28, 14F
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11/09 02:29, 4年前 , 15F
看有沒有其他更有經驗的大大願意分享(?)，因為我自
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11/09 02:29, 4年前 , 16F
己有時遇到也滿頭痛的
11/09 02:29, 16F
謝謝大大提供的方向！
推
11/09 08:10, 4年前 , 17F
叫你學姐和你side-by-side染一次 她一個口令你一個動作
11/09 08:10, 17F
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11/09 11:39, 4年前 , 18F
兩個人相同材料各做一次，先排除人的問題
11/09 11:39, 18F
就是學姊們已經畢業了只能隔空抓藥QQ ※ 編輯: isorange (49.216.22.31 臺灣), 11/09/2020 12:06:39
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11/09 17:29, 4年前 , 19F
避光有確實嗎？之前sorting時發生過隨著時間PE訊號越來越
11/09 17:29, 19F
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11/09 17:29, 4年前 , 20F
強，後來推斷是PE-Cy7斷了恢復成PE,不過那只發生在舊抗體
11/09 17:29, 20F
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11/09 17:29, 4年前 , 21F
，換新抗體後就沒再發生過了
11/09 17:29, 21F
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11/09 19:25, 4年前 , 22F
你用接了biotin的抗體染Ly6c，有記得染二抗嗎？
11/09 19:25, 22F
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11/09 19:26, 4年前 , 23F
抱歉，回太快，沒看清楚是CD11b沒染到
11/09 19:26, 23F
推
11/09 20:55, 4年前 , 24F
有沒有可能抗體舊了染的效果不好了？
11/09 20:55, 24F
有避光且都放在冰上，已經是新買的了嗚嗚
推
11/09 21:07, 4年前 , 25F
我蠢了沒看到....染不均勻的可能性？
11/09 21:07, 25F
謝謝大大，我下次往這個方向修正看看
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11/09 21:13, 4年前 , 26F
CD11b 跟Ly6c 是分開染還是一起染？
11/09 21:13, 26F
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11/09 21:16, 4年前 , 27F
另外抗體clone物種來源是否都是rat ?
11/09 21:16, 27F
是一起染的喔！來源也都是一樣的 ※ 編輯: isorange (101.14.194.128 臺灣), 11/10/2020 01:54:13
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11/10 08:47, 4年前 , 28F
染個BD compBeads就可以知道抗體有沒有訊號了
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11/10 12:12, 4年前 , 29F
請分開染 clone物種來源一樣很常會有染不到情形 除非
11/10 12:12, 29F
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11/10 12:12, 4年前 , 30F
是不同物種 比如rat & rabbit 才可以costain 妳的學姐
11/10 12:12, 30F
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11/10 12:12, 4年前 , 31F
當初應該是挑了不同物種的clone才costain成功
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11/11 18:45, 4年前 , 32F
等等樓上是 biolegend (跪
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12/04 14:48, 4年前 , 33F
1.PECy7 channel確定可以detect到嗎? 2.換個顏色吧!
12/04 14:48, 33F
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03/05 20:08, 4年前 , 34F
你的Buffer有加界面活性劑打洞細胞壁嗎？
03/05 20:08, 34F
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03/08 13:33, 4年前 , 35F
細胞膜啦(蠢)
03/08 13:33, 35F
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