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[求救] 免疫沉澱（IP)問題

看板Biotech (生命科學)作者 (Dawn)時間3年前 (2021/08/21 12:41), 3年前編輯推噓5(5推 0噓 34→)
留言39則, 6人參與, 最新討論串1/1
前輩好 最近要做IP後跑western ，實驗室以往沒有做過沒有人可以詢問，所以研究有些吃力，研 究許多protocol 後，有問題幾個問題想請教前輩。 先簡要敘述步驟： 蛋白定量後的樣品與（1.適量一抗）混合overnight,隔天加入活化後beads 約兩小時抓下 抗原抗體，（2.清洗）後離心留下沈澱物，加入（3.sample dye) 30uL，加熱95度/5分鐘 ，完成。 請問前輩 1. 適量一抗一般標準是多少，第一次做該如何決定？ 2. wash 沈澱物步驟，實驗室beads的datasheet 中寫「water」，我覺得有些奇怪，也有 看過中文論文以RIPA buffer 及 wash buffer ，不知何者較常見？ 3.沈澱物加入30uL sample dye，所有的中英protocol 都這樣寫。我有一些疑問,以下有 四： a. 所以sample 最後只有30uL 嗎？！ 這樣不是很濃嗎！跟先前定量的感覺也沒有關聯呀 ？ b. 之後跑western 膠要load多少量呢？ c. Beads 是不是也在dye裡 ，也會被load進去嗎...... d. sample dye(6X) 應該要先稀釋成1X再加入30uL 嗎？ 先謝謝前輩指教了！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.217.136.33 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1629520890.A.666.html
推
08/21 19:53, 3年前 , 1F
實驗室之前有做過western嗎？
08/21 19:53, 1F
推
08/21 19:55, 3年前 , 2F
如果沒有，建議你先研究western 的原理，IP只是樣本前處理
08/21 19:55, 2F
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不同而已
有做過，我會再多了解！ 08/21 19:55
推
08/21 21:52, 3年前 , 4F
珠珠load進去沒關係，會卡在well裡面，不會跑進膠裡面
08/21 21:52, 4F
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, , 5F
之前做完IP要拿去打質譜前是這樣弄的
好的！了解 謝謝 08/21 21:52
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08/22 14:43, 3年前 , 6F
IP抗體用量看datasheet,或參考abcam "Unpurified antibody
08/22 14:43, 6F
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08/22 14:43, 3年前 , 7F
concentrations"有相關的用量介紹
08/22 14:43, 7F
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08/22 14:43, 3年前 , 8F
原則上wash會是PBS不是水,通常是當初用的lysis buffer或去
08/22 14:43, 8F
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08/22 14:44, 3年前 , 9F
除detergent成分的buffer等,像是CSK buffer
08/22 14:44, 9F
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08/22 14:45, 3年前 , 10F
RIPA不適合在coIP或一般IP當wash buffer使用
08/22 14:45, 10F
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08/22 14:56, 3年前 , 11F
多數IP能抓的是原本lysate的10~20%的蛋白,太多sample dye
08/22 14:56, 11F
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08/22 14:58, 3年前 , 12F
沒必要,以30ul來說,剛好可以跑1次膠跟保留1次repeat機會
08/22 14:58, 12F
謝謝您的詳細解說，跟您確認一下我的理解是否正確！ 所以我原先認為只有30uL會有很 濃度蛋白是不對的想法，因為IP後的蛋白可能剩不到兩成，所以跑膠時load量仍跟平常差 不多（10uL/well)嗎 ※ 編輯: dawnga (49.217.3.144 臺灣), 08/22/2021 16:16:45
推
08/22 22:54, 3年前 , 13F
建議跑IP之前，先測試該細胞裡你想要抓的蛋白的表現量，這
08/22 22:54, 13F
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08/22 22:54, 3年前 , 14F
樣才有辦法決定你要下多少蛋白量去抓。一抗要買有標可以IP
08/22 22:54, 14F
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08/22 22:54, 3年前 , 15F
的抗體，濃度可以先參照上面寫的。至於要loading 多少量，
08/22 22:54, 15F
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08/22 22:54, 3年前 , 16F
也是參照表現量而定。就像前面說的，可以抓下來的量可能很
08/22 22:54, 16F
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08/22 22:54, 3年前 , 17F
少，你如果還loading很少，可能也無法被偵測到。假設protoc
08/22 22:54, 17F
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08/22 22:54, 3年前 , 18F
ol 是建議用30ul去煮，通常就是全部loading 進去（使用大
08/22 22:54, 18F
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08/22 22:54, 3年前 , 19F
的well),你說的10ul/well,應該是小的well
08/22 22:54, 19F
謝謝！！我這幾天很忙碌沒有時間回覆，感謝你的幫助，我有成功哦
推
08/25 11:35, 3年前 , 20F
1. 一般第一次我會用 1ug 抗體去抓 沒濃度的話用 1ul
08/25 11:35, 20F
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08/25 11:35, 3年前 , 21F
2. 我一般用 2x sample elution , 效果會比一倍的好 (
08/25 11:35, 21F
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08/25 11:35, 3年前 , 22F
我同學也有人用 5X的，只是很難 pipet)
08/25 11:35, 22F
謝謝！我跟您一樣使用兩倍所以成功了，但是請教一下，一倍效果不好會看到什麼狀況嗎 ？
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08/25 14:34, 3年前 , 23F
bead體積殘餘的wash buffer不管再怎麼處理都不能完全去除
08/25 14:34, 23F
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08/25 14:35, 3年前 , 24F
所以放1x elution一定會稀釋,效果想必不好
08/25 14:35, 24F
了解了 謝謝您～
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08/25 19:21, 3年前 , 25F
抗體用量建議做個titration，bead其實有一種filter
08/25 19:21, 25F
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08/25 19:22, 3年前 , 26F
column可以把elution buffer 和 bead 分開，通常加了多
08/25 19:22, 26F
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08/25 19:23, 3年前 , 27F
少bead我就當作他體積有多少(就算是slurry也一樣)，然
08/25 19:23, 27F
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08/25 19:23, 3年前 , 28F
後用那個體積去回推要加幾倍的sample buffer。
08/25 19:23, 28F
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08/25 19:24, 3年前 , 29F
Wash buffer要用什麼其實很不一定，看你實驗的目的決定
08/25 19:24, 29F
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08/25 19:25, 3年前 , 30F
，如果你只是要抓target protein，wash可以用比lysis
08/25 19:25, 30F
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08/25 19:25, 3年前 , 31F
buffer更強的(如NaCl濃度提高)去洗，但是如果你是要抓
08/25 19:25, 31F
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08/25 19:26, 3年前 , 32F
其他和target protein在一起的蛋白質(也就是其實是做
08/25 19:26, 32F
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08/25 19:26, 3年前 , 33F
co-IP)，通常就是直接用lysis buffer去洗，而且lysis
08/25 19:26, 33F
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08/25 19:27, 3年前 , 34F
buffer不會用到RIPA，通常是用triton或NP40這類不會破
08/25 19:27, 34F
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08/25 19:28, 3年前 , 35F
壞蛋白質構型的兩性分子配製lysis buffer。
08/25 19:28, 35F
謝謝您的詳細說明～這幾天有點忙沒有時間回覆，非常感謝你的幫助，我有成功哦，而且 得到了很多小知識，這個實驗室只有我一個人，所以在學習上有些辛苦（汗
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08/31 23:30, , 36F
同前面推文說的，通常是用之前的 lysis buffer 洗，然後 3
08/31 23:30, 36F
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08/31 23:30, , 37F
0 ul beads 我是用 30 ul 2X sample buffer，煮了以後 spi
08/31 23:30, 37F
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08/31 23:30, , 38F
n down beads，如果不想 load beads 到 wells 裡，可以用
08/31 23:30, 38F
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08/31 23:30, , 39F
細長的那種 gel loading tips。
08/31 23:30, 39F
謝謝你的說明，很詳細讓我完全了解，不會不知道自己為什麼這樣做！ ※ 編輯: dawnga (49.217.0.206 臺灣), 09/12/2021 10:32:50
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