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[討論] 點突變如何成功

看板Biotech (生命科學)作者 (opport)時間3年前 (2021/09/14 15:18), 3年前編輯推噓5(5推 0噓 10→)
留言15則, 7人參與, 3年前最新討論串1/1
小弟使用PCR進行點突變 目標是改為下圖的大寫GCC https://i.imgur.com/T3iWSFN.jpg
實驗流程是PCR進行點突變，利用設計好的兩個引子，會擴增出帶有目標區域的質體，接 著使用DpnI進行消化，消化掉帶有甲基化的質體股 PCR program： 95 蚓 5 mins 95 蚓 30 sec 55 蚓 30 sec 用的是CloneAmp HiFi premix 68 蚓 3 min 30 protocol提供的溫度參考 68 蚓 7 mins 25 蚓 1 mins 引子的黏合溫度 軟體是估60.6 不過學長覺得可能亂黏 就改成55了 引子當初設計的時候全長為26 Forward Reverse為互補 DpnI消化O/N 是由於引子長度太短導致黏不上嗎 還是TM值抓的太低 小弟能想到的只有這兩個可能性 最後都有去做定序 都沒有挑到成功的 希望各位高手大哥大姐們 多多指教 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.117.70 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1631603886.A.7B0.html
推
09/14 16:25, 3年前 , 1F
問題是什麼? 菌不長? 挑出來不對? 還是根本沒P出東西
09/14 16:25, 1F
→
09/14 17:25, 3年前 , 2F
既然有學長就請學長來解決了
09/14 17:25, 2F
推
09/14 21:04, 3年前 , 3F
gcc是要改成什麼?用backtoback比較容易...
09/14 21:04, 3F
※ 編輯: nm768417 (1.165.158.144 臺灣), 09/14/2021 23:50:52
推
09/15 00:33, 3年前 , 4F
annealing溫度調低一定接得上吧？倒是可能增加非特異性結合
09/15 00:33, 4F
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09/15 00:33, 3年前 , 5F
的機率，primer設計阿肥乍看之下沒什麼問題，硬要說的話3'
09/15 00:33, 5F
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09/15 00:33, 3年前 , 6F
那邊可以再少一個T，點突變兩側GC比例高一些會比較好接上去
09/15 00:33, 6F
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09/15 00:33, 3年前 , 7F
是說DpnI切O/N不會太久喔？現在幾乎都time-saving，15分鐘
09/15 00:33, 7F
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09/15 00:33, 3年前 , 8F
就搞定，阿肥頂多給他切到一個小時，切久好像容易出事
09/15 00:33, 8F
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09/15 05:42, 3年前 , 9F
template上是GCC, 設計的 primer也是GCC。這是有改嗎？
09/15 05:42, 9F
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09/15 08:00, 3年前 , 10F
我預設原po是不小心打錯，實際上有改XD
09/15 08:00, 10F
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09/15 14:17, 3年前 , 11F
應該說引子是GCC 所以模板預測出來是GCC 上面的圖片是
09/15 14:17, 11F
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09/15 14:17, 3年前 , 12F
成功後出來的預測結果
09/15 14:17, 12F
推
09/16 00:12, 3年前 , 13F
所以原本究竟是什麼？要改成GCC
09/16 00:12, 13F
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09/16 11:49, 3年前 , 14F
原本是R
09/16 11:49, 14F
推
09/17 10:32, 3年前 , 15F
你的 vector 是 3.5kb？
09/17 10:32, 15F
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