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[求救]設計同基因 老鼠和人 都要的QPCR primer

看板Biotech (生命科學)作者 (有人試我的密碼，幹)時間3年前 (2021/10/19 00:24), 3年前編輯推噓5(5推 0噓 33→)
留言38則, 8人參與, 3年前最新討論串1/1
要設計在老鼠和人都能用在同一個gene的primer， sample是老鼠的tail genomic DNA 目標是找出 基因轉殖鼠有無成功攜帶人的同一個基因，這是在轉殖鼠上 另外，需要在wildtype老鼠上也能p到它自己野生型， 老闆希望用qpcr去算插入基因的copy number 我從researchgate上找到的流程，如下 1) First take the sequence you need from database (NCBI...) in fasta format. Take the same orthologous gene from rat, mouse and human. 2) Align them (nucleotide sequence) using MUSCLE ( https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ ) 3) Take the conserved region/regions and design primers. You can use IDT primer quest online software (https://www.idtdna.com/pages ). Test for primer dimers and haipins with oligoanalyzer tool (IDT). 4) Blast your primers in https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn to be sure about specificity. 前兩步照著做，但我找到相似的區域後是用primer-blast找出primers database選Genomes for selected organisms (primary reference assembly only) Organism 除了 Homo Sapiens還加Mus mouse, genus (taxid:10088) https://imgur.com/0ekjsDl
從primer-blast結果，人的部分 primer完全match。 老鼠有幾個mer不太合， forward的3'端有倒數第5個不太合 reverse，是倒數第4個 我記得應該是最後三個match就有機會做出來(？) 但是結果只有人的有訊號 https://imgur.com/39QAfgO
PCR condition: 95 5min, 95 30sec, 58 15sec, 72 15sec, 72 5min; 40 cycles 板上有無人有做過此類實驗的經驗？ 我是要把PCR condtion在做調整，還是primer設計哪裡有誤？ -- https://tinyurl.com/4b99rnwc 尋找投資機會 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.25.226.148 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1634574252.A.826.html
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10/19 00:54, 3年前 , 1F
小鼠的變異很靠3'端啊，你怎麼會覺得沒問題？甚至有三個變
10/19 00:54, 1F
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10/19 00:54, 3年前 , 2F
異的
10/19 00:54, 2F
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10/19 02:55, 3年前 , 3F
找出轉殖鼠有無攜帶人類基因？那為什麼要能同時放大老
10/19 02:55, 3F
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10/19 02:55, 3年前 , 4F
鼠的？這樣如果有產物你要怎麼分是放大到人類的還是老
10/19 02:55, 4F
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10/19 02:55, 3年前 , 5F
鼠的基因片段？
10/19 02:55, 5F
推
10/19 07:30, 3年前 , 6F
有mismatch的primer需要更低的annealing溫度，PCR條
10/19 07:30, 6F
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10/19 07:30, 3年前 , 7F
件58C 15sec夾不到就再降溫度，56C、54C、52C、50C
10/19 07:30, 7F
推
10/19 07:41, 3年前 , 8F
另一個方法則是重新設計Primer，盡量找完全match的，
10/19 07:41, 8F
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10/19 07:41, 3年前 , 9F
再不然match最多只集中在5'端5個mer。
10/19 07:41, 9F
推
10/19 07:51, 3年前 , 10F
目標是確認轉殖鼠有沒有目標人類基因………那你就設計夾
10/19 07:51, 10F
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10/19 07:51, 3年前 , 11F
那個基因的primer啊？人的DNA是...positive ctrl?
10/19 07:51, 11F
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10/19 08:23, 3年前 , 12F
別調整了,你的PCR結果已經說明這老鼠帶有人的轉植基因了
10/19 08:23, 12F
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10/19 09:11, 3年前 , 13F
我需要同樣可已看到老鼠wildtype的
10/19 09:11, 13F
※ 編輯: pent (223.136.150.94 臺灣), 10/19/2021 09:16:37 ※ 編輯: pent (223.136.150.94 臺灣), 10/19/2021 09:18:00
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10/19 10:39, 3年前 , 14F
primer在mismatch的位置設計成degenerate code
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10/19 13:13, 3年前 , 15F
我來做的話，如果可以找到 >20 bp 人類和老鼠完全相同
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10/19 13:13, 3年前 , 16F
且適合作為 primer 的序列，只需要一個這樣的區域設計
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10/19 13:13, 3年前 , 17F
primer 1，然後人類和老鼠各設計一條 primer 2-1 和 p
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10/19 13:13, 3年前 , 18F
rimer 2-2，且人類和老鼠的PCR產物大小不同可以跑膠分
10/19 13:13, 18F
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10/19 13:13, 3年前 , 19F
辨，以後GT就3條 primer 丟在一管一起做PCR，然後可以
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10/19 13:13, 3年前 , 20F
跑膠看出是M/M、H/M或是H/H。如果都找不到共同>20 bp
10/19 13:13, 20F
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10/19 13:13, 3年前 , 21F
可設計的序列，就直接設計2對primer分別做人類和老鼠
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10/19 13:13, 3年前 , 22F
，只要設計的夠好4條丟同一管做也不會有影響
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10/19 16:09, 3年前 , 23F
對了，不考慮加一個 positive control?
10/19 16:09, 23F
推
10/19 22:52, 3年前 , 24F
向樓上說的設計人鼠2組就好啦，為什麼要複雜化
10/19 22:52, 24F
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10/19 22:53, 3年前 , 25F
不然就像另外2位說的，人鼠都能P到那你怎麼知道是人還是鼠?
10/19 22:53, 25F
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10/19 22:55, 3年前 , 26F
要分出人鼠的話也要像xx說的那樣設計三條來配對吧
10/19 22:55, 26F
推
10/20 19:08, 3年前 , 27F
用qpcr去算插入基因的copy number ->成功拜託跟我說一聲
10/20 19:08, 27F
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10/21 22:17, 3年前 , 28F
我覺得我大概猜到你們想幹嘛了，之所以要設計人類老鼠
10/21 22:17, 28F
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10/21 22:18, 3年前 , 29F
都能做的 primer，是為了用WT老鼠本身帶有的2個allele
10/21 22:18, 29F
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10/21 22:19, 3年前 , 30F
去當做標準，然後用qPCR算TG數比WT多帶了幾個copy吧？
10/21 22:19, 30F
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10/21 22:20, 3年前 , 31F
首先.....這種做法必須要保證primer在人類老鼠都有100%
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10/21 22:20, 3年前 , 32F
的序列，否則就會因為有mismatch造成放大效率不一，然
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10/21 22:21, 3年前 , 33F
後即使primer binding site序列完全一樣，人類老鼠PCR
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10/21 22:22, 3年前 , 34F
產物的序列不同也就有可能影響放大效率了，primer也不
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10/21 22:22, 3年前 , 35F
能用前幾樓提到的degenerate code去做。總之，只要你沒
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10/21 22:23, 3年前 , 36F
辦法在人類和老鼠上找到完全一樣的兩個可以設計primer
10/21 22:23, 36F
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10/21 22:23, 3年前 , 37F
的區域，那就不用想用這個方法去算copy number了
10/21 22:23, 37F
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10/22 13:38, 3年前 , 38F
感謝，有相關paper。
10/22 13:38, 38F
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