[討論] lambda red recombination問題
各位前輩大家好
最近嘗試使用lambda red recombination剔除E.coli(BW25141)的目標基因(972 nt)
方法是將含有pKD46的E.coli 在10mM的arabinose的誘導下養至OD0.4，在用去離子水清洗後做成competent cell
之後以目標基因上下游各50nt結合pKD3 priming site位置的引子，pcr出左右端是目標基因上下游，中間是pKD3 CmR含promoter的序列(1134 nt)
在透過電穿孔將pcr產物送進competent cell後，在LB養兩個小時，然後塗抹在chloramphenicol的盤子上(25 micro gram/mL)，之後挑選single colony做colony pcr確認
神奇的是，不管以目標基因本身的序列或是CmR的序列來做pcr都能得到相對應大小的pcr產物，感覺是recombination錯了地方，不僅目標基因沒被剔除，還把CmR序列接了進去，不曉得有沒有前輩有類似的經驗可以分享，感謝
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