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[求救] SDS-PAGE上膠會阻擋loading

看板Biotech (生命科學)作者 (芒果是藍波萬)時間11月前 (2023/05/13 17:36), 11月前編輯推噓8(8推 0噓 40→)
留言48則, 13人參與, 11月前最新討論串1/1
各位好 我通常都是做完膠之後凝固overnight 但有時候會遇到上膠會形成一層薄膜 阻擋loading 導致sample沒辦法好好到well底部 甚至漂起來跑到隔壁well的情形 同時做好幾片膠 有的沒有這種情況有的就有 想請問各位有沒有遇過這類情形，都是怎麼解決的呢？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 39.12.2.166 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1683970570.A.718.html ※ 編輯: QuteMango (39.12.2.166 臺灣), 05/13/2023 17:36:53
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05/13 18:57, 11月前 , 1F
你是不是拿到.75的comb
05/13 18:57, 1F
沒有拿錯comb 但的確感覺像是comb兩側有一層薄薄的膠 tip下去的時候就會把它往下推 導致影響loading 不知道要怎麼避開這個問題QQ
推
05/13 20:03, 11月前 , 2F
製膠的Buffer pH值跑掉了，換掉就好了
05/13 20:03, 2F
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05/13 21:53, 11月前 , 3F
這個問題沒有親眼看到倒底是怎麼個薄膜法，我覺得很難
05/13 21:53, 3F
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05/13 21:54, 11月前 , 4F
除錯....
05/13 21:54, 4F
今天跑膠的時候忘記拍起來了QQ 不過大概也只能看到Sample load不下去的樣子，薄膜應該看不清楚
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05/13 22:03, 11月前 , 5F
沒有耶 確定是1.5mm的comb 用新訂的commercial buffer
05/13 22:03, 5F
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05/13 22:03, 11月前 , 6F
也是一樣有這個情況
05/13 22:03, 6F
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05/13 22:03, 11月前 , 7F
會是跟凝overnight 有關係嗎？
05/13 22:03, 7F
※ 編輯: QuteMango (39.12.2.166 臺灣), 05/13/2023 22:04:45 ※ 編輯: QuteMango (39.12.2.166 臺灣), 05/13/2023 22:06:44
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05/14 00:04, 11月前 , 8F
凝膠時的保濕措施怎麼做的？
05/14 00:04, 8F
沒有保濕耶 就放在bench上overnight 如果做完凝固後泡在running buffer隔日再使用可能會比較好嗎？
推
05/14 10:39, 11月前 , 9F
用二次水噴瓶沖洗well有用嗎？
05/14 10:39, 9F
不曉得欸 感覺有點難沖掉 ※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/14/2023 16:21:50
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05/14 16:23, 11月前 , 10F
沒有保濕，還直接放bench上，那大概是乾掉了
05/14 16:23, 10F
推
05/15 10:28, 11月前 , 11F
不懂凝固為什麼要overnight? 這樣膠不就壞了嗎？
05/15 10:28, 11F
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05/15 15:18, 11月前 , 12F
之前實驗室是放overnight凝的比較好，我也有看到protoc
05/15 15:18, 12F
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05/15 15:18, 11月前 , 13F
al是這樣做的。不過也有可能現在的實驗室都是24小時有
05/15 15:18, 13F
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05/15 15:18, 11月前 , 14F
空調，所以不適合這樣做。
05/15 15:18, 14F
推
05/15 15:58, 11月前 , 15F
不就是殘膠嗎
05/15 15:58, 15F
不確定您指的殘膠是如何？如果是指well兩側多的膠體 那應該就是QQ
推
05/15 18:10, 11月前 , 16F
我使用Bis-Tris gel，從4%到20%，都是15-20分鐘內會凝
05/15 18:10, 16F
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05/15 18:10, 11月前 , 17F
膠，然後馬上可以跑。不知道是不是你使用的gel不同或是
05/15 18:10, 17F
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05/15 18:10, 11月前 , 18F
APS壞了，才會需要這麼長時間去凝固
05/15 18:10, 18F
抱歉先前沒有提到 我是用Tris-Glycine的膠 應該不是APS壞掉，我都是配好後分裝冰-20，每個月都會換新的，而且不是不凝，只是和 樓下說的一樣，之前的實驗室教說overnight可以讓膠聚合的更好
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05/15 18:25, 11月前 , 19F
雖然很多Lab都是膠凝了就拿來跑，可是事實上要讓PAGE完
05/15 18:25, 19F
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05/15 18:26, 11月前 , 20F
全polymerize最好放個overnight，我自己經驗的確放o/n
05/15 18:26, 20F
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05/15 18:27, 11月前 , 21F
的膠跑起來會比較漂亮，但是這不是必要的，bis-tris的
05/15 18:27, 21F
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05/15 18:27, 11月前 , 22F
膠因為pH的關係會比較快凝
05/15 18:27, 22F
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05/15 18:29, 11月前 , 23F
要凝o/n需要注意不能讓stacking乾掉，可以在加完stack-
05/15 18:29, 23F
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05/15 18:29, 11月前 , 24F
ing gel以後加一層水、酒精或isopropanol，不建議用run
05/15 18:29, 24F
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05/15 18:30, 11月前 , 25F
buffer，stacking的pH和running buffer不一樣，泡runn-
05/15 18:30, 25F
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05/15 18:31, 11月前 , 26F
ing buffer會讓stacking gel的pH跑掉，然後還是需要用
05/15 18:31, 26F
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05/15 18:31, 11月前 , 27F
保鮮膜或夾鏈袋把鑄膠臺包起來避免蒸發
05/15 18:31, 27F
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05/15 18:41, 11月前 , 28F
05/15 18:41, 28F
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05/15 18:42, 11月前 , 29F
這篇的 3.3 看一下
05/15 18:42, 29F
感謝您的建議 我晚點研究一下這篇文章 想請問您是在放齒梳後加酒精/異丙醇/水嗎？這樣不會直接流下去嗎（困惑）？ ※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/15/2023 19:00:59 ※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/15/2023 19:02:45 ※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/15/2023 19:05:38
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05/15 19:29, 11月前 , 30F
我是下膠壓水凝O/N，上膠隔天要跑才做
05/15 19:29, 30F
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05/15 20:14, 11月前 , 31F
這個方法好像也不錯，請問上膠凝多久呢？15-30分鐘？
05/15 20:14, 31F
推
05/16 00:28, 11月前 , 32F
上膠凝30分鐘左右即可
05/16 00:28, 32F
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05/16 00:28, 11月前 , 33F
我泡整塊的native gel (TBE buffer, 5% glycerol, acrylami
05/16 00:28, 33F
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05/16 00:28, 11月前 , 34F
de/bis=29:1)不時也會出現文中所述的薄膜，解決方法是把tip
05/16 00:28, 34F
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05/16 00:28, 11月前 , 35F
插到well最底部再load下去XD。至於SDS上膠倒是沒遇過這情況
05/16 00:28, 35F
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05/16 00:30, 11月前 , 36F
個人覺得跟是否放過夜凝固沒有關係，但也想不出有什麼原因
05/16 00:30, 36F
推
05/16 09:29, 11月前 , 37F
不就只是多餘膠體阻礙樣品下沉嗎 拿個tip或針頭清掉
05/16 09:29, 37F
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05/16 10:51, 11月前 , 38F
我上膠是凝30分鐘
05/16 10:51, 38F
推
05/16 17:59, 11月前 , 39F
看起來是殘膠的問題 通常好像都是comb的問題.. 之前換
05/16 17:59, 39F
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05/16 17:59, 11月前 , 40F
了另一批comb之後就好了 然後如果有殘膠的話就拿針頭去
05/16 17:59, 40F
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05/16 17:59, 11月前 , 41F
沖well把他沖掉 不過要小心不要吸到膠會吸破
05/16 17:59, 41F
好像也蠻有可能的，因為我總覺得不是膠體乾掉造成的，因為是在well寬的地方的兩側， 而且同時做的膠有的有有的沒有。 也感謝提過解決的方法，我下次試試看 ※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/16/2023 19:21:20 ※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/16/2023 19:23:06
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05/16 20:52, 11月前 , 42F
上膠區域只有玻璃,com,跟配好的pre-mix,不是膠乾掉那會是?
05/16 20:52, 42F
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05/16 20:52, 11月前 , 43F
膠還是現做現用吧,1小時可以能做完的事,放O/N反而增加麻煩
05/16 20:52, 43F
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05/16 20:52, 11月前 , 44F
而且既然為了方便buffer都是買配好的了,不需浪費這時間
05/16 20:52, 44F
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05/16 20:56, 11月前 , 45F
至於美觀,像下膠的band會微笑,band寬窄不一,15個well前後
05/16 20:56, 45F
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05/16 20:58, 11月前 , 46F
兩個常跑不好,像這些常見的情況都不是做膠放不夠久的問題
05/16 20:58, 46F
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05/16 21:01, 11月前 , 47F
如果想跑得漂亮一點,加入sample的影響還是關鍵得多
05/16 21:01, 47F
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05/21 23:12, 11月前 , 48F
你的尺梳沒洗乾淨，有殘膠．DNA agarous gel 也一樣有
05/21 23:12, 48F
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