Re: western做不出來~~~
==> sys (none) 提到:
> ==> heienken@kkcity.com.tw (奶酥麵包) 提到:
> > 想請教各位高手~~
> > 我用bio-rad的NC paper壓neutrophil的total p38 （antibody是cell signal）
> > 壓overnight出來只有弱弱的一條band (protein load的量是５０ug)
> > （用同樣的蛋白質量一秒GAPDH就強得不得了）
> > 於是我改用Pall corporation的PVDF
> > (PVDF用前先泡一下methanol→用三次水wash一下→泡transfer buffer五分鐘。
> > 之後的過程都沒有讓PVDF乾掉)
> > 哇～～～結果壓出來也是弱弱的一條band
> > 各位高手幫我想想辦法啊～～～
> 1. methanol rinse過後 直接放transfer buffer
> 2. 換新的antibody 或是調高濃度
> 另外
> 很多條件都不清楚耶
> 像是用什麼detect
> transfer有沒有注意溫度
> antibody的concentration
也不清楚原本的表現量是否就這麼低，原作是做control麼？
還是internal control那條band很強，實驗組卻很弱？
methanol rinse後，有沒有用三次水洗過，一般並無太大關係，
不放心的話也可以直接放transfer buffer搖。
另外，transfer出來，可以先觀察一下membrane上面有沒有已經轉過去的band，
(這是假設表現量夠多，可以看到一條條的lane之痕跡)
如果轉不太過去，回頭檢討transfer的condition，電壓與時間的設定如何？
(甚至機器有無損壞、buffer有無配錯等等)
如果轉好的band很清楚，但壓出來卻很弱，再考慮其後步驟是否出問題；
例如antibidy活性還在不在？diluted之濃度是否正確？
first antibody是否容易被洗掉還是結合蛋白質之力量很強？
可看看之前的背景是乾淨的還是有點黑的？太乾淨的話可再檢討顯色和壓片的步驟。
......可能的問題太多了，
先檢視一下可以改善的步驟會比較容易汰選出真正有問題的地方...
加油...
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非常寂寞時 才發現你在夢裡
在靈魂裡 下著我最後的細雨
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