Re: western做不出來~~~

看板Biology (生物學)作者Anemos (寶寶)時間20年前 (2004/10/17 02:22)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《heienken@kkcity.com.tw (奶酥麵包)》之銘言： : 想請教各位高手~~ : 我用bio-rad的NC paper壓neutrophil的total p38　（antibody是cell signal） : 壓overnight出來只有弱弱的一條band (protein load的量是５０ug) : （用同樣的蛋白質量一秒GAPDH就強得不得了） GAPDH本來就是over expression了,所以一秒就很強很正常, 但如果GAPDH有壓出來,在transfer後也有看到marker又過去的話, 那代表transfer的過程應該沒有問題,protein一定有過去而且看樣子,顯影用的reagent也沒問題, 看在GAPDH有壓出來的份上,暫且就推測在transfer之前所有步驟, 到block結束wash染一抗之前都沒問題(不過原PO很多沒講,也不知道有沒有問題) 所以如果有問題的話, 或許是antibody的efficency的問題,不然就是真的這個protein本來就是低表現level, 不知道這個實驗有沒有做positive control,如果沒有的話, 老實說,其實也無從比較實驗組是真的表現較弱或是antibody efficency不好 : 於是我改用Pall corporation的PVDF 我使用的經驗,NC paper做出來的解析度比較高,比較清楚, 雖然PVDF做起來比較不容易破,很好使用,不過用久了個人還是偏好NC paper做出來的data, 而且NC paper比PVDF優越的地方在stripping後,NC paper上的protein維持得比較好, PVDF上的protein在經過stripping後,容易出現坑坑洞洞的 : (PVDF用前先泡一下methanol→用三次水wash一下→泡transfer buffer五分鐘。 ~~~~~~~~~~~~~~ 不要用水wash了 PVDF泡methanol可以泡久些,至少要泡到有點半透明的感覺,transfer才會好, 我記得Pall corporation公司的說明書好像有寫,泡完methanol後, 要再放在transfer buffer些時間,讓membrane適應適應 : 　之後的過程都沒有讓PVDF乾掉) : 哇～～～結果壓出來也是弱弱的一條band : 各位高手幫我想想辦法啊～～～說不定這個結果是真的呀!說不定他真的本來就該這麼弱 ^_^ -- ╱▎ ╱ ▎ ＿＿ ╱￣￣▎ ☆°．﹒‧°★°．﹒‧°﹒▕智為▏～人生僅是無端虛無夢幻～ ╱︠ nemos～☆°．﹒‧°★°．﹒‧°﹒ ￣￣☆°．﹒～或者了然於天地間～ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.117.191.32 ※ 編輯: Anemos 來自: 140.117.191.32 (10/17 11:05)