Re: 為何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度ꐠ…

看板Biology (生物學)作者aggaci (好想學鋼琴阿!!)時間19年前 (2005/11/02 17:16)推噓0(0推 0噓 0→)

留言0則, 0人參與討論串1/1

※ 引述《u860427@yahoo.com.tw (u860427)》之銘言： : ※ 引述《wuko.bbs@bbs.nsysu.edu.tw ()》之銘言： : > 轉信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!news.nct : > Origin: bbs.nsysu.edu.tw : > 為何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度之初,就被洗出來? : > 我利用大腸桿菌來表現6xHis-protein, : > 經過IPTG誘導後, : > 破菌! : > 將上清液灌入nickel column, : > 在wash時, 沒事! : > 但是在0~500 mM imidazole拉梯度（二十倍體積）之初, : > 我的6xHis-protein 在一開始（一倍體積）體積, 就被洗出來! : > 所以我的nickel column拉梯度圖, : > 就在最前面只出現了一根很大根的peak! : > 然後就持平到最後, : > 經過western blotting分析後才發現, : > 我的6xHis-protein在前面這根很大根的peak裡面, : > 但是這根很大根的peak裡面還伴隨著數百種蛋白質, : > 請問怎麼會這樣呀? : 有幾種可能 : 1.你把His tag接在protein的哪一端? : 在N-ter的話因為它是先被製造出來的,所以很可能folding時被包進去了,造成binding能力不足.建議接在C-ter : 2.設計時的問題 : 若His tag本身離protein太近也會造成tag無法隨意飄動,或幅度太小,建議可於prtein與tag間加上一個cutting site (ex:factor X)反正也方便將純化後的tag切掉,或者是多接一點His,我一般都用10個His喔 : 3.實驗準備上的問題 : 你的column用了多次的話就應該要re-charge,或column中的EDTA或imidazole是否有清洗乾淨.再者你的所有buffer是否有會干擾實驗的物質,或你的梯度拉的太快,loading時流速過高,都會有所影響喔 : 4.命不好 : 其實做蛋白質實驗常常會是聽天由命的,表現量,純化結果等等.基本上本人也發身過許多次.但基本上盡力而為囉 5.charge可以試試鈷離子... binding較強 6.試試GST或是MBP fusion protein吧.... His-tag我覺得不太好用.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.63.11