Re: [問題] 請問有關western blot抗體使用
※ 引述《hurp (LentiVirus)》之銘言：
: ※ 引述《ginmol (儲備博士)》之銘言：
: : 我有幾個有關western blot的問題想請教各位先進：
: : 1. 一級抗體的稀釋溶液何種較佳？可使其能夠保存重複使用？
: 以Santa Cruz p53 DO-1 antibody為例, 我將ab 1:3000 泡在 1X TBST
: with 0.05% Sodium Azide, 可加 4%奶粉. 存放及使用都是在4度C. 這一管東西,
: 我平均一個禮拜用一次以上, 回收再用. 再沒有補加ab的情況下,
: 目前已經邁向第三個月了. 效果依舊很利.
: 要注意的是一抗跟二抗之間的wash要充分, 例如 1X TBST 15 min X 4 time.
: 把Sodium Azide 充份洗去, 因為這東西好像會影響二抗HRP的活性.
: : 2. 是否曾嘗試以微量反應體積覆蓋membrane的方式進行抗體抗原反應？
: 我是用小塑膠袋封裝membrane, 以mini gel的面積來說, 大約6~8 ml的 ab溶液.
: 我同學是把membrane 裝進 50 ml試管, 也是加 6~8 ml的溶液. 放入摩天輪去轉
我們實驗室都是用養菌的Agar plate
上面先放幾百microliter的抗體溶液(依照membrane面積大小而異)
然後將membrane直立在吸水紙上方瀝乾殘留液體
將transfer蛋白質那一面membrane朝下泡在含有抗體的Agar plate中
使用此法須注意
1.Agar plate需保持水平否則抗體溶液會亂流
2.盡量不要將membrane靠近plate周圍
否則抗體溶液流到plate會因表面張力加速擴散到plate周圍
使抗體溶液離開membrane與plate底部交界
: : 3. 一般蛋白loading量約多少較為適當？
: mini-gel, 7.5 mm 厚. 我一般loading從 20 ~ 60 ug, 取決於你想看的protein本身
: 的量多不多.
: : 4. AP與HRP系統，何者的訊號強度較高？
: 我個人偏好HRP, 雖然較不方便, 但訊息比較敏銳. 如果你用好一點的ECL kit,
: 訊號會很強.
: : 感謝各位的回答.......
: 以上是小弟的經驗, 煩請大家指正. 感恩. 也祝大家實驗順利.
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