Re: 請問有關PCR的問題
※ 引述《KAEDERUKAWA.bbs@bbs.csie.ncu.edu.tw (uranff)》之銘言：
: 現在我想要做一個3kb左右的PCR
: 由於之後要接著做cloning，所以比較要求準確性
: 先前試過的幾個PCR酵素搭配模式：
: pfu DNA polymerase (Promega) only (0.6U in 25ul)（使用期限僅到今年五月）
: Blend Taq DNA polymerase (Toyobo) only (0.5U in 25ul)
: Viogene Taq DNA polymerase (5U in 25ul) + pfu (同前) (0.6U in 25ul)
: （用這種搭配模式的原因是因為有看過paper利用pfu專責做更正）
: 使用的template：cDNA （以random primers做RT）
: condition：95℃ 5min
: 95℃ 1min
: 69℃ 1min (35 cycles)
黏合溫度太高
可以試著降低一點
我不知道你的incert是有做什麼處裡(修飾還怎樣的)
但是以我做cloning的小小經驗
溫度降到58度都可以做出來
還有一般來說
我做pcr若片段長度超過800bp我才會調成1min
不然一般elongation的時間都大致在30-40秒上下
你可以試著調整自己的protocol看看
pcr會夾不出來
除了你忘記加temple.dNTP之外(真的會忘記加 XD)
最重要的就是引子黏合的溫度了
: 72℃ 7min
: 72℃ 15min
: （另外，第一組用pfu的在denature及anneal都拉長到3min，後來聽同事意見改短）
: 結果只有第一組pfu only有跑出一條700bp左右的band，其他兩組完全跑不出來
: 這樣子的話，我要從哪一方面著手改，才能夠跑得出來呢？
: 我一個同學有跟我說過，他們那邊用Merck的pfu DNA polymerase，可以很輕鬆的跑到12kb
: 難道真的要換Taq來做才做的出來嗎？
: 謝謝
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