[求救]molecular cloning
※ [本文轉錄自 Biotech 看板]
作者: kws6874 (煜凱) 看板: Biotech
標題: [求救]molecular cloning
時間: Wed Feb 20 23:56:40 2008
最近經由RT-PCR方式要 clone 一段1480bp的片段到pcDNA3.1(-)的vector上..
.
確認原先primer已設計Bam HI與Eco RV位置無誤外,另外還在尾端多增加7mers作為
提升PCR products digestion efficiency...
可是..藉由37度C最佳buffer作用2小時及純化後..再以insert:vector > 6的ratio進行
ligation及transformation竟然沒長半顆clones...實驗所使用的enzyme及competent
cells都已再三確認其功效無誤... 但試了幾次都結果失敗...
另外,則是以T-A cloning方式進行cloning... transformation結果是OK...也看到
colonies長出來.. 但經由藍白篩過濾挑選剩餘colonies進行PCR check ..始終沒挑到
想要的clones..
請大家幫幫我想一下問題可能是出在哪個地方.. 感激不盡...
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