Re: [求救]molecular cloning
※ 引述《kws6874 (煜凱)》之銘言：
: ※ [本文轉錄自 Biotech 看板]
: 作者: kws6874 (煜凱) 看板: Biotech
: 標題: [求救]molecular cloning
: 時間: Wed Feb 20 23:56:40 2008
: 最近經由RT-PCR方式要 clone 一段1480bp的片段到pcDNA3.1(-)的vector上..
: 確認原先primer已設計Bam HI與Eco RV位置無誤外,另外還在尾端多增加7mers作為
: 提升PCR products digestion efficiency...
: 可是..藉由37度C最佳buffer作用2小時及純化後..再以insert:vector > 6的ratio進行
: ligation及transformation竟然沒長半顆clones...實驗所使用的enzyme及competent
: cells都已再三確認其功效無誤... 但試了幾次都結果失敗...
: 另外,則是以T-A cloning方式進行cloning... transformation結果是OK...也看到
: colonies長出來.. 但經由藍白篩過濾挑選剩餘colonies進行PCR check ..始終沒挑到
: 想要的clones..
有時候, 所有材料與藥品, 甚至水都確認無誤, 但仍然是clone不出來時,
要考慮一個因素: 是否你的insert被表達出來以後, 會對細菌造成影響甚
或有毒性? 如果有毒性, 那不論你怎麼篩, 都是得不到, 或者得到突變的
insert, 因為細菌也是想要活下去的.
由Invitrogen的知識庫可知pCDNA的CMV promoter即使在細菌中也有
basal expression, 要想知道你的insert表達後是否對細菌有毒性,
測試辦法是做個Blunt End ligation. 你可以用TOPO-Zero-blunt kit,
或者乾脆把你的PCR產物(Pfu的產物是Blunt, Taq的不是, 用個Exonuclease
I之類的東西把它變成Blunt end)放進EcoRV切過且去磷酸化的pCDNA3中.
如果你clone出來的東西, 大部分都是倒置的(C->N), 就可知道你insert
的表達產物有毒性, 細菌不喜歡.(我曾做過一個東西, 挑16個colonies全部倒置)
如果你的實驗不允許倒置的clone, 解決方法就是找個完全不能表現的系統,
比方用expression-free cloning vectors, 像在insert前, 真核promoter之
後, 插一個原核transcriptional terminator. 這樣既不影響真核細胞內表
現, 又可以讓insert不在細菌內表達. 實際做法或序列可以參考
Lucigen的cloneSmart系列, 祝你好運
http://www.lucigen.com/catalog/index.php?cPath=15_16
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