Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？

看板Biotech (生命科學)作者Resd (遙遠的未來)時間20年前 (2005/05/12 15:14)推噓1(1推 0噓 1→)

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※ 引述《eriel.bbs.@bbs.life.nchu.edu.tw (C'est)》之銘言： : ※ 引述《Resd.bbs@ptt.cc (遙遠的未來)》之銘言： : > 方便請問你詳細的步驟嗎? : > 我現在也在做plaque assay : > 可是都做不出來 :( : > 實驗室以前沒人做過 : > 我查到的有用neutral red染色也有用結晶紫染色的 : > 我現在用neutral red去染不過都沒有結果 : > 不知道是哪個步驟出了問題 : 我們實驗室也是用結晶紫 : 你可以把你作plaque assay步驟說出來給大家聽 : 這樣我們也好提供意見給你我上次做是fallow我找到的一篇論文用6 well去做，cell先在6well中養一天，隔天加入不同倍數的病毒稀釋液，37C感染兩小時之後用PBS wash 三次。然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell， (用2%的agarose跟2倍濃度的medium做1:1稀釋)。然後37度C倒置培養三天。再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小時之後觀察。 (這當中medium 加2ml是我自己試的，因為paper上沒寫該加多少後面加0.5ml也是）之後我有問到另一個protocol 不過因為不是很確定這當中的步驟所以還沒有做另一個protocol如下：（以下的步驟不是我寫的，請不要引用，謝謝） 1.病毒以漢克緩衝液 (Hank's solution) 做十倍連續稀釋，由10-1稀釋至10-7。 2.把單層細胞的上清液吸掉後，加上病毒稀釋液0.05 ml，每一稀釋液接種二個洞(well) 並放置在37 ℃溫箱一小時，其間每十五分鐘搖動一次，使病毒可充分與細胞接觸。 3.二倍的Eagles液與二倍高級瓊脂等量混合，即成一倍的工作液，(Eagles 培養液放在 37 ℃水箱半小時) ，此時溫度約為41℃，每一洞內加0.5ml。 4.放37 ℃溫箱培養，並含二氧化碳2.5 %。 5.48～96小時，顯微鏡觀察有CPE時，以10% 福馬林固定液一滴加於一個洞中，過夜。 6.固定後之微量盤置於水龍頭下，以水沖掉瓊脂，倒放，使水份流乾。 7.以1 % 結晶紫染液二滴染色一分鐘，再以自來水沖洗染液，直至無染料洗出為止。 8.自然乾燥後，便顯出無色的不規則空洞。我看不懂的是5～6的部分步驟5，10%福馬林加下去之後，agar會溶掉嗎？還是會滲進去？這時候應該是要放回37度C吧？那要倒放還是正放？步驟6是我最困惑的地方，用水把agar沖掉，cell不會因此跟著被沖掉嗎？另外就是，這些含有病毒的東西，沖到水槽去會不會怎樣？請有經驗的人幫我解答一下好嗎？謝謝！這個實驗我實在是從來沒做過，實驗室也沒有其他人在做一切都是我用想像的然後去試試看 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.91.78.235