Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
※ 引述《Resd (遙遠的未來)》之銘言：
: ※ 引述《eriel.bbs.@bbs.life.nchu.edu.tw (C'est)》之銘言：
: : 我們實驗室也是用結晶紫
: : 你可以把你作plaque assay步驟說出來給大家聽
: : 這樣我們也好提供意見給你
: 我上次做是fallow我找到的一篇論文
: 用6 well去做，cell先在6well中養一天，
: 隔天加入不同倍數的病毒稀釋液，37C感染兩小時之後用PBS wash 三次。
: 然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell，
: (用2%的agarose跟2倍濃度的medium做1:1稀釋)。然後37度C倒置培養三天。
: 再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小時之後觀察。
: (這當中medium 加2ml是我自己試的，因為paper上沒寫該加多少
: 後面加0.5ml也是）
: 之後我有問到另一個protocol
: 不過因為不是很確定這當中的步驟 所以還沒有做
: 另一個protocol如下：
: （以下的步驟不是我寫的，請不要引用，謝謝）
: 1.病毒以漢克緩衝液 (Hank's solution) 做十倍連續稀釋，由10-1稀釋至10-7。
: 2.把單層細胞的上清液吸掉後，加上病毒稀釋液0.05 ml，每一稀釋液接種二個洞(well)
: 並放置在37 ℃溫箱一小時，其間每十五分鐘搖動一次，使病毒可充分與細胞接觸。
: 3.二倍的Eagles液與二倍高級瓊脂等量混合，即成一倍的工作液，(Eagles 培養液放在
: 37 ℃水箱半小時) ，此時溫度約為41℃，每一洞內加0.5ml。
: 4.放37 ℃溫箱培養，並含二氧化碳2.5 %。
: 5.48～96小時，顯微鏡觀察有CPE時，以10% 福馬林固定液一滴加於一個洞中，過夜。
: 6.固定後之微量盤置於水龍頭下，以水沖掉瓊脂，倒放，使水份流乾。
: 7.以1 % 結晶紫染液二滴染色一分鐘，再以自來水沖洗染液，直至無染料洗出為止。
: 8.自然乾燥後，便顯出無色的不規則空洞。
: 我看不懂的是5～6的部分
: 步驟5，10%福馬林加下去之後，agar會溶掉嗎？還是會滲進去？
: 這時候應該是要放回37度C吧？ 那要倒放還是正放？
: 步驟6是我最困惑的地方，用水把agar沖掉，cell不會因此跟著被沖掉嗎？
: 另外就是，這些含有病毒的東西，沖到水槽去會不會怎樣？
: 請有經驗的人幫我解答一下好嗎？ 謝謝！
: 這個實驗我實在是從來沒做過，實驗室也沒有其他人在做
: 一切都是我用想像的然後去試試看
For plaque assays, confluent MDCK cell monolayers in 6-cm
dishes were infected with 10-fold dilutions of recombinant
viruses in a total volume of 1 ml of PBS–0.2% BSA for 1 h.
Cells were washed with PBS–0.2% BSA and covered with an
overlay of MEM containing 0.5% purified agar (Oxoid Ltd,
Basingstoke,Hampshire, England), 0.02% BSA, and 0.001% DEAE
-dextran. Cells were incubated at 37C under 5% CO2, and pl
aques were stained 3 days postinfection with 0.1% crystal violet
in a 10% formaldehyde solution.
<出處>
Interdependence of Hemagglutinin Glycosylation and Neuraminidase as
Regulators of Influenza Virus Growth: a Study by Reverse Genetics
<中文>
關鍵之處大概是在於 結晶紫是泡在福馬林液裡面 同時固定跟染色的
stained with 0.1% crystal violet in a 10% formaldehyde solution
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