Re: [問題] 請問有關T細胞亞群抗體染色
Flow Cytometer的結果是"相對"的
你會需要先用negative control設好"negative"
然後用positive controls/compensation cotrls
設FITC only和PE only的signal
稍微詳細的步驟如下:
1. 在work sheet 上畫一個"aquisition" dot plot
(FACS的軟體 CellQuest把圖分兩種 Analysis和Aquisition
用Aqusition mode收集data, Analysis mode把data叫出來分析)
2.叫出Amp/Detector控制板 (Cytometer->Amp/Detector)
記得把FITC(FL1)和PE(FL2) channel選為Log mode
(螢光強度一般用Log scale)
3. 上negative control 設negative signal
Cytometer->Amp/Detector
調Amp把所有的細胞點都設在你要的地方
一般大家都是把negative 設在0和10^1之間
記得要調FITC的也要調PE的
4. 叫出compensation控制板
Cytometer->Compensation
5. 上compensation control
(1) FITC only-
應該只會出現在第二象限(FITC pos only)的細胞點
出現在第一象限(FITC and PE double pos)
調FL2- %FL1 --視螢光強度而定 FACS一般是18%-26%
(2) PE only
應該只會出現在第四象限(PE pos only)的細胞點
出現在第一象限(比較靠近第四象限的地方)
調FL-1- %FL2 --FACS一般是0.8%-1.2%
-把false "double positive"的訊號調為single positive就可以了
千萬不要把細胞點壓得太低(細胞點不要貼到軸上)
6. 調完所有control，設定就不能動了
這時候你就可以看你真的要分析的樣本
-google 一下 Purdue的Flow cytometer
我覺得他們的討論版還不錯，可惜我是在學會Flow才發現這個版
-可以翻一下current protocol in immunology和
current protocol in flow cytometer
-四象限區分其實很簡單
看過一次就很難忘記
所以只要你找一個有經驗的人帶你上機
一定可以學到
(FACS是貴重儀器，要使用的人應該都要受過訓練
如果你問，帶你的人一定會示範)
-在看螢光強度前，要記得用FSC vs SSC 把細胞和死細胞碎片分出來
-我一般習慣另外用PI區分死細胞和活細胞，只看活細胞的螢光強度
並不是每個實驗室都會這麼做，可是強力推薦
everblue
--
※ 發信站: 批踢踢參(ptt3.cc)
◆ From: 67.10.241.33
討論串 (同標題文章)
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
-9
12
9
46