Re: [問題] 凍細胞的方法

看板Biotech (生命科學)作者evilest (地球太危險了…)時間19年前 (2006/06/08 18:28)推噓6(6推 0噓 0→)

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※ 引述《CD3 (tot)》之銘言： : 我是使用DMSO作為抗凍劑 : 希望有人能提供詳盡的步驟 : 謝謝 DMSO最好使用 for gas chromatography的 (MERK,100ml瓶裝，小貴) 如果你只有 for spectroscopy的 (MERK,500ml瓶裝，便宜好幾倍)，那也行不過建議以上兩種要分裝時都要用0.2μm的filter先濾過，把裡面的雜質渣渣和細菌都濾掉 (尤其是如果你的DMSO是和別人共用的，就一定要先濾!) 這裡我以SP2小鼠骨髓癌瘤細胞為例，細胞凍存： 1.先鏡檢細胞健康狀況，通常在視野下長到八成滿，細胞粒粒圓潤飽滿，處於對數生長期，即是最加凍存時機。 2.配DMSO凍存液 (要現配，不能前一天配好放著備用)： DMEM:DMSO:FBS=3:1:4 即50%FBS DMSO凍存液，有的書上用20%FBS (即DMEM:DMSO:FBS=7:1:2)，我沒試過，你可以試試看，可以的話告訴我一聲XD~ 3.倒掉舊medium，加入DMEM，使用γ滅菌過之滴管將細胞沖下來 (這只是SP2 細胞的處理方式，其他細胞有不同的處理方式)，倒入50ml離心管中離心 ( 850 rpm，5分鐘)。 4.倒掉上清液，用指腹將沉澱下來的細胞打散，冰浴下加入之前配的DMSO凍存液如果細胞是養在T80 Flask中，這時細胞數目約為1×10^7個/ml，則要加3ml的 DMSO凍存液，分裝成三個冷凍小管(每管1ml)，將細胞密度控制在1×10^6個/ml。 5.將細胞懸液分裝入冷凍小管後，旋緊管蓋。在小管上標明細胞名稱、培養液名稱和凍存日期及操作人。 6.放進15ml離心管的25孔保麗龍底座中，在-20℃下放置30分鐘 (有的書上寫4℃/ 30分鐘，你也可以試試看XD~)。 7.用3~4張報紙 (經驗談：水果日報最好用，紙質超厚使用多次不會爛，加上時常有美女圖賞心悅目…) 將25孔保麗龍座包好，丟進-80℃冰箱中over night (注意!!一定不能倒放，不然以後解凍時你就準備爆吧…)。 8.隔天將冷凍小管移入液態氮中，如果你很忙的話，冷凍細胞可以在-80℃冰箱中放3~4個禮拜，不過還是儘早移啦!畢竟有時會有天災 (停電) 人禍 (白目學弟妹冰箱沒關好或放假前把"所有"的電器用品關機…)，早移早安心咩~ 9.冷凍小管移入液態氮桶時一定要快，不能讓冷凍小管回溫，一旦回溫到-30℃以上時就會開始長冰晶，如果動作比較慢的人，建議可以取些液態氮到冰桶中，將冷凍小管先浸在液態氮中，這時就可以慢慢記錄冷凍小管在液態氮桶中的位置，然後歸位。先醬子，細胞冷凍和解凍講究的是『慢凍快融』，冷凍細胞比較沒有什麼小撇步解凍細胞就有很多小撇步來增加細胞存活率，等下次再寫唄~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.79.172