[求救] 請問 genomic DNA 的 PCR
各位好
我現在是用 人類細胞株中抽取的 genomic DNA 當作 template 進行 PCR
想要 P 出一段長度約 3 K 的 promoter region
之前可能因為 primer 沒有設計好 一直 P 不出來
重新設計 primer 後 是可以在正確位置看得到 band
可是 不管怎麼改變 annealing 的溫度 或 DNA template 的量..
甚至是增加 cycle 數 (35 --> 40)
都沒有辦法讓這 band 的 signal 強一點
量一直都非常少....
我的 PCR condition 如下:
98 ℃, 3 min
98 ℃ 1 min
61.0 or 58.0 ℃ 40 sec
72 ℃ 3 min ×35 or 40
72 ℃ 10 min 4 ℃ ∞
DNA template 的量 則是從 3 ng --> 2 ug 都試過了
不是 P 不出 就是只有微弱的 band
Primer 則 FW RV 各加 100ng
要提到的是 因為是 promoter region
兩個 primer 都有 GC-rich 的情況
FW 還好 ( 55 %)
但 RV 的 GC 高達 66.67 %
不知道這是否影響了我 PCR 的產率?
還是 DNA template 不夠乾淨??
或說這樣的 PCR 還有什麼需要特別留意的地方??
謝謝各位的指教~~謝謝!!
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白天不懂夜的黑
太陽不解月的悲
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◆ From: 140.112.60.46
※ 編輯: ZecAhau 來自: 140.109.224.35 (11/12 23:36)
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