Re: [問題] 有關cloning的問題

看板Biotech (生命科學)作者werthers6925 (...)時間19年前 (2007/01/10 12:57)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《anchi (請給我胖老鼠~~~)》之銘言： : 我想要clone 人類chromosome上的某個基因, : 之後要接到retroviral的vector上, : 請問,有辦法直接用設計兩端primer方式,夾出這個基因嗎? : (之前做細菌某基因的clone會用這個方法,不曉得是否可用在人類chromosome上?) : 還是,要用取出RNA做RT PCR 方式做出cDNA,再去接vector? : 另外,假設預計要用的vector是pSIR, : 若我想把上面的promoter換成另一個,要怎麼換? : 可以直接用restriction enzyme切下原本promoter區域, : 然後ligase欲換的promoter上去嗎? : 這樣,是不是還要確認nucleotide base數目是否有shift? : 第一次做這方面,請問大家, : 我這樣的實驗設計對不對,有沒有錯誤需要修改或需要注意的事項? : 謝謝~ 你可以直接設計兩端primer去夾但是設計完的的primer請你上NCBI去做Blast 以及去UCSU去做預測, 看是否真的只會夾到你要的gene NCBI blast: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ UCSU PCR: http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr 如果都沒問題...你應該可以直接用genomic DNA直接做不過...請你考慮你要的target gene 在genome上是否有intron的存在...如果有intron... 建議你還是從cDNA開始釣吧另一各問題, 關於promoter..... 如果我沒記錯....promoter應該是沒有nucleotide base shift的情形... 所以...你如果想簡單做...用酵素切一切接一接應該就可以了... 但是請注意...不是所有的promoter都適合拿來用有些promoter需要enhancer或是其他element才能作用.... 你要考慮進去....... 不同的promoter距離start site的遠近也不一樣基本上...一般常用的promoter都是經過測試過的如果你要換promoter....你不仿參考這各promoter他們是怎麼設計的你再考慮是否要這樣做吧...... 願順利 BEST -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.54.2