Re: [問題] 關於Ni2+ column

看板Biotech (生命科學)作者skylawer (skylawer)時間19年前 (2007/01/11 01:28)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《iceoo (醉心於巴黎)》之銘言： : ※ 引述《iceoo (醉心於巴黎)》之銘言： : : 請問一下在用imidazole洗純化之蛋白質的時候 : : 因為用1M imidazole去洗還是得不到我要的蛋白質 : : (用SDS-PAGE沒壓到但pri-bind有壓到) : : 所以就再提高imidazole的濃度當提高到2M時 : : 在洗的過程中帶有Ni2+的 resin逐漸由綠色轉為紫色 : : 請問是為什麼呢我再用PBS wash後又恢復成綠色了 : : thx! : 推 Bluecold:pH? 01/10 06:49 : 推 aggaci:沒結合上去吧?通column前後，target protein量有改變嗎? 01/10 14:19 : 推 wensing:用到1M imidazole相當高濃度！ 01/10 18:00 : → wensing:我只用300mM就可以洗下來了！ 01/10 18:01 : 推 alaric:你的cell extracts有表現? 01/10 21:27 : 謝謝各位的回答應該有結合上去我的蛋白質是可溶的 : 破菌後上清液(un-bind)是有表現的菌液用column bind O/N後流出來的液體(pri-bind : )target protein量有變少很多(coomassie和Western都一樣結果雖然很難 : 去估計pri-bind和un-bind load的protein是否等量) : 所以我推測應該是有bind 只是沒沖下來...而且column為什麼會變成紫色呀 : 我有去找可是找不到答案很詭異... 1M imidazole 下不來很不尋常 (且不合理) 用 0.5 M EDTA 把 Ni 懈下來吧.. 看 protein 有沒有跑出來再沒有 0.1M NaOH wash 把 protein denature 下來吧走到這一步代表你protein 已 aggregate 在 gel 內那你 condition 要改善... maybe 是 pH or ion strength Ni離子的確會隨著配位數不同是會從藍綠--> 藍-->紫色 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.68.74.146