Re: [問題] 請問pull down assay跟CO-IP的差別...

看板Biotech (生命科學)作者newivan (.......................)時間19年前 (2007/01/12 16:49)推噓3(3推 0噓 2→)

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※ 引述《linzhengzhan (研究所：碩士班vs博士班)》之銘言： : ※ 引述《sezko (一般大學比較適合我)》之銘言： : : 請問一下這兩種方式的差別是什麼呢..?? : : 是不是因為pull down assay並不是使用抗體所以才另外取一個名字的阿..?? : : 兩者不都是觀察protein的interaction狀況嗎..?? : : 還有pull down的專一性是否沒有CO-IP高呢..?? : : 謝謝解答阿....拜託拜託....... : co-ip是用antibody與antigen的特異性來操作protein interaction的實驗，事實上 : antibody的性質好壞與否，會決定實驗的品質與，甚至成敗…… : －A protein Ab.－A protein－B protein : ^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^^ : 成敗的關鍵↑　　　　　　　↑有興趣的protein　　　　　 : 　 : 而pull down assay是將已知的protein做成fusion protein (ex.GST)，利用enzyme- : substract的specificity來將已知的protein抓著固定，之後再與其他protein : interaction，所以嚴格說不會有上述的問題…… : ex. : Glutathione－GST－A protein－B protein : ^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^^ : ↑Matrix ↑fusion protein ↑有興趣的protein : 所以你要說這兩個方法那一個比較好，見人見智；因為這兩個方法都是Paper中，公認的 : 方法…… Co-IP 與 Pull down assay 的確都是用來證實 protein-protein interaction 的方法不過它們各有各的優缺點及限制 Co-IP: 實驗步驟較簡單,但是較浪廢 antibody,其限制在於只能證實 indirect interaction,且容易有 contaminated signals, wash buffer 的離子濃度以及 wash 的次數都要控制的當才不會導致誤判. Pull down assay: 通常是用兩個 pruified proteins 來進行,其中一個 protein fused 到 tag (如上敘的 GST)當成 bait, 藉由 pull down fusion protein 而將另一個 protein (當 prey) 給抓下來,因為是由兩個 purified proteins直接進行, 所以可證實此兩 proteins 為 direct interaction 而不藉由其他的 proteins. 不過 purified proteins 大多是在 E.Coli中 overexpression,很可能因為沒有正常的 protein folding 或者 modification 而導至誤判.不過現在已經有一些在真核細胞中 overexpression 的 system, 可以克服 folding 及 modification 的問題了. 進行此兩實驗時都必需有適當的 negative control才能下結論,否則可能因 wash buffer 濃度 or wash 次數不同而得到不同的結果,至於哪一個的 specific 較好,我想是取決於兩 proteins interaction 的強弱, 用 antibody 做 IP 不是也常常抓到一堆雜 bands 嗎. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.74.200