Re: [求救] cloning~~~cloning~~
※ 引述《baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)》之銘言：
: 想請問大家CLONING~~~拜託拜託~~~
: 做好幾個月了~~還是弄不出來~~
: 我的insert約1.8kb~~在PRIMER上設計BamHI 與 SmaI切位
: 後來實在沒辦法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC)
: 我使用的VECTOR有6.8kb
: 後來做SUBCLONE還是接不進去~~
: GEL EXTRACTION的KIT是用慧眾的~~
: 看圖是都有切但是就是接不進去
: 有可能是酵素亂切嗎?!BUF壞掉嗎~~???!!!!
: 嗚嗚~~~求救~~~
: _
由於你給的資訊很少, 因此就你所給我們的資訊,
我們也很難正確的幫你判斷你真正的問題出在哪裡.....
頂多只能告訴你該做什麼control, 該留意什麼事情....
如果可以的話, 不知你是否願意寫的詳細一點....
包括 TA-vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱?
vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱?
(這樣方便我上網找出map, 進而判斷在vector上的cut site是否選取恰當,有問題)
最好是能把實驗流程寫一下.....
RE怎樣作用?在什麼溫度?用什麼buffer?
怎樣純化DNA?用什麼方法?什麼KIT?
您寫的越詳細, 我們才能精確的幫您判斷可能發生問題的因素.....
言歸正傳......根據你所給的資訊....而加以推論.....
你的insert最出是用PCR的方式做出...並且primer上加上BamHI and SamI....
-->做不出來!! (可能是由於primer上5'端沒有額外加base所造成)
之後, 你將insert接在TA-vector上....
並且先用SmaI再用BamHI切.....
-->仍然做不出來!!
(因為insert已經接在TA-vector上..就和primer上5'端有無額外加base已經無關...
推翻先前假設.....)
先用SmaI切, 假設你是用NEB的RE....
SmaI是用NEB buffer4.....
就算你沒有換buffer直接加入BamHI作用....
BamHI在buffer4的作用活性也有75%.....
因此RE在insert上的作用應該很好........
接著看vector的作用能力.....
你說你的transformant colonies長的很多, 但很可惜沒有做vector的control....
由於你的colony長很多...但卻沒有一各是你要的clone....
因此就可以直接看成是vector的control....
(雖然不知道挑出來的是vector only還是雜菌.....)
也就是說.....你的vector作用不好......
你的問題....應該是出在RE作用在vector這各地方.....
至於原因為何?
由於您給的資料很少....所以無法判斷.....
以上小弟推論.....不知有無幫上忙....
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