PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] cloning~~~cloning~~

看板Biotech (生命科學)作者 (大笨蛋大笨蛋~~~~~)時間19年前 (2007/02/14 22:18), 編輯推噓12(12推 0噓 8→)
留言20則, 5人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
想請問大家CLONING~~~拜託拜託~~~ 做好幾個月了~~還是弄不出來~~ 我的insert約1.8kb~~在PRIMER上設計BamHI 與 SmaI切位 後來實在沒辦法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC) 我使用的VECTOR有6.8kb 後來做SUBCLONE還是接不進去~~ GEL EXTRACTION的KIT是用慧眾的~~ 看圖是都有切但是就是接不進去 有可能是酵素亂切嗎?!BUF壞掉嗎~~???!!!! 嗚嗚~~~求救~~~ _ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.60.28
推
02/14 22:29, , 1F
TA 接進去了?
02/14 22:29, 1F
推
02/14 22:35, , 2F
嗯嗯對阿~~我在PCR產物後加A~~用TA的KIT接近去了~~
02/14 22:35, 2F
推
02/14 22:40, , 3F
那你確定你subclone用的vector接點跟你的insert兩端互補嗎
02/14 22:40, 3F
推
02/14 22:42, , 4F
我用vector切位也是BAMHI跟SMAI兩沏位鄰近
02/14 22:42, 4F
推
02/14 23:13, , 5F
蝴蝶牌的Sma I的限制酵素切割的溫度為25度喔 這點有注意到嗎
02/14 23:13, 5F
推
02/14 23:33, , 6F
有～～水浴25切
02/14 23:33, 6F
推
02/14 23:37, , 7F
你接在TA vector上 可個別切一刀 試試看是否是buffer或是限
02/14 23:37, 7F
→
02/14 23:39, , 8F
製酵素的問題..還有你的DNA濃度呢
02/14 23:39, 8F
推
02/14 23:42, , 9F
切一刀都沒問題～～我用2500ng去切insert
02/14 23:42, 9F
→
02/14 23:46, , 10F
切完後 純化的濃度呢
02/14 23:46, 10F
推
02/14 23:50, , 11F
在ＴＡ上ㄉＩＮＳＥＲＴ切下來2刀下來後剩385ng
02/14 23:50, 11F
推
02/15 02:31, , 12F
你所謂接不進去是什麼樣的狀況? control 和 ligation 的
02/15 02:31, 12F
→
02/15 02:31, , 13F
transformant 一樣多? 還是比較多但找不到正確的 clone?
02/15 02:31, 13F
→
02/15 09:15, , 14F
你的vector夠純嗎 將其純化再用限制酵素作用看看
02/15 09:15, 14F
→
02/15 09:16, , 15F
另外可以的話兩刀分開切(vector)
02/15 09:16, 15F
推
02/15 09:52, , 16F
我的transformants滿多的~~淡沒有做VECTOR ONLY的CON~~~
02/15 09:52, 16F
→
02/15 10:09, , 17F
我是先沏SMAI再沏BAMHI~~~
02/15 10:09, 17F
推
02/15 13:32, , 18F
vector only 是絕對必要的 可能你得到的都是 self-ligate
02/15 13:32, 18F
→
02/15 13:34, , 19F
看來還是 vector 處理的問題 下次接時用「少很多」vector
02/15 13:34, 19F
→
02/15 13:35, , 20F
再接接看 還有記得補上 vector only
02/15 13:35, 20F
‣ 更多 baca 的文章
文章代碼(AID): #15qnfFgv (Biotech)
討論串 (同標題文章)
以下文章回應了本文：
完整討論串 (本文為第 1 之 3 篇)：
排序： 最新先 | 最舊先 | 留言數
12
20
[求救] cloning~~~cloning~~
baca
19年前, 02/14
在新視窗開啟完整討論串 (共3篇)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 baca 的文章
文章代碼(AID): #15qnfFgv (Biotech)