Re: [求救] 抗過敏的細胞實驗_RBL-2H3

看板Biotech (生命科學)作者threestars (等待)時間19年前 (2007/07/08 20:55)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《cytospin (My Ernest)》之銘言： : ※ 引述《K587262 (風......何時再起)》之銘言： : : 請問板上的各位大大有人做過利用RBL-2H3進行抗過敏的細胞模式嗎 : : 實驗大致是利用anti-DNP IgE鍵結到RBL-2H3上的Fc receptor : : 爾後加入DNP-BSA與IgE進行cross linking引發肥大細胞去顆粒化的反應 : : 但是我實驗怎麼作都無法誘導出細胞去顆粒化 : : 利用cell lysis的確可以利用分光檢測出去顆粒化酵素的存在 : : 所以我不知道問題出在哪想請問板上是否有人也在研究相關的實驗 : : 可以給我一點建議跟指導謝謝 : 我用過BMMC做過不過我是用loading IgE 之後用anti IgE 座crosslinking : 不過我想使用DNP-BSA 來corsslinking specific IgE效果應該更好 : 想請問你測試的方法是啥?? : 1. Ca++ influx? 2. B-Hex 3. histamine release?? : 1.需要特殊的儀器不過只要幾顆細胞就可以了 : 之前研究過了一下後來就因為太懶惰所以沒做:P : 我個人使用過的是2 and 3 2其實超快兩個小時就搞定拿數據又便宜 : 但是問題是我的感覺是他不是linear的而且每個lab處理程序不太一樣 : 導致% release其實很有問題就是不同實驗室做出來的數據其實不太能比較 : 而且我同一批樣品測2漢3 計算出來的%就是有差阿 : 我看不懂你所說的degranulation enzyme存在是什麼?? : 是說b-Hex? 還是??????? : 我第一個想法是你的buffer是使用含有Ca 美離子的嗎用DPBS應該是無效 : 因為degranulation需要有鈣離子存在通常使用的就是tyroid buffer之類的 : 除了specific IgE之外你可以用A23187/PMA Compound 48/80 來做control : 對了ConA基本上就是人工corsslinking FceRI 也是可以用的 : 至少先找出是assay出問題還是他真的不會degradation : 還有就是有些細胞養太久會lost FceRI expression : 或者是impariment of FceRI signling : 看到有人在做這題目真的覺的親切阿..... : 雖然RBL不算mast cell.... 我有用RBL-2H3 就像上面講的他是basophils cell （雖然有一些PAPER會寫他是mast cell line）我常做的是 beta-Hex calcium influx 也有做過其實這個ASSAY我覺得並不是一個穩定的實驗實驗中任何一個條件不佳都會導致數據大幅波動我用的是anti-DNP IgE 先sensitized RBL-2H3 cell 接著使用DNP-BSA stimulation DNP是半抗原如果沒有高度重覆比較難有cross-linker 我們使用BSA conjugated DNP DNP-BSA 可以跟sigma 買就如之前講的每個LAB應該都會有一些不一樣要先試出一個你們lab 使用較佳的條件我想以下幾點可以提供你參考 1. cell number ：因應妳所實驗的需求有時會有好幾天的不同處理這是妳要找出一個較理想的細胞數除了之前所說的養太久如果ASSAY時細胞過於擁擠就會有較差的效果 2. medium的狀態：要處於正常養分狀態 2005年我忘了是blood 還是J Immunol 有提到在飢餓的環境下 RBL釋放會有不正常的干擾 3. IgE and DNP-BSA concentration A.IgE concentration 基本上 RBL-2H3 beta-hexosaminidase release的效果來至於 IgE cross-linking 所以提供局夠量的IgE來佔據Fc epsilon RI是實驗所必須的可以簡單的試出一個IgE的濃度是可以達到最低有效釋放率濃度 B. IgE versus DNP-BSA DNP-BSA並不是加越多就效果越強 DNP-BSA如果太高量的話會形成一個DNP-BSA佔據一個IgE 這樣的話就將不容易形成cross-linker 釋放的效果也就大打折扣有時妳可能會看到一些PAPER會有這樣的實驗圖所以DNP-BSA 會有一個 optimal concentration 要試出自己LAB 最好的 DNP -BSA conc. 4. assay buffer for degranulation 前一個有提到必須有Ca and Mg 在degranulation時必須要有 calcium influx 的提供這邊用什麼buffer 我發現每個實驗室都有一些差異我們使用 tyrode's buffer 也有用過 modify過的tyrode's buffer 我通常會在buffer加入　1％　ＦＢＳ我覺得buffer是影響這個 assay最常發生的影響 5. beta-NAG and sodium bicarbonate buffer 通常這邊不易有問題容易有問題的是 beta-NAG 比較難溶有時還為溶解完畢就拿去做實驗實驗時你們會必須做一組使用triton X lysis 的Total release 如果這邊有正常顯色那應該這兩個buffer 就沒問題 calcium influx 也和beta Hex 差不多不過Positive control 可以使用 PMA ionomycin 祝實驗順利歐 -- 為什麼解剖背了那麼多次還是不會寫為什麼藥物化念了好幾遍還是算不完為什麼生藥結構念了就忘西索：你的敗因在於認識不足過度使用記憶體～～ORZ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.174.141