Re: [求救]關於DNA fragmentation
※ 引述《doskoi (doskoi)》之銘言：
: 最近要做apoptosis
: 老闆想看DNA fragmentation
: 可是卻做不出來
: 先說說我的作法
: 為了先試試技術可不可行
: 我利用3mM的H2O2去treat SKBR3 cell
: 6個小時後收cell抽DNA
: 跑2% agarose gel
: 卻只能看到well下方一大團DNA,沒辦法看到ladder
: 是我treatment的方法有問題嗎?
: 還是抽DNA出問題?
我詳述一下我抽DNA的方法
大家看看有沒有問題
1.收cell後加入lysis buffer (10mM EDTA, 50mM Tris-HCl, 0.5% sarkosyl, ph=8)
2.lyse後加入proteinase K (final 1mg/ml),56度3hr
3.加入RNAse A (final 1mg/ml),56度1hr
4.之後加入兩倍體積的phenol/chloroform/IAA(25:24:1),混合後靜置30分鐘
5.在4度c以12000g離心15分鐘
6.取上清液加入3倍體積的無水酒精和1/10的sodium acetate,靜置-20度30分鐘
7.以12000g離心15分鐘,移除上清液後用75%酒精wash pellet
8.再一次12000g離心15分鐘,移除上清液後將pellet乾燥
9.再以TE buffer如解pellet後就測濃度跑膠了
這算是傳統方法了吧
這樣抽不到嗎?
我看paper方法都很類似
還有更好的方法嗎? kit除外,因為沒錢ORZ
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推
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