Re: [求救] flag-tagged protein expression
Hi,
有可能是 1. 沒有表現
2. 有表現, 那些雜 band 可能是 splicing variants
建議:
1. 先測序一下, 看 gene 是否 in frame
2. 如果序列都對, 在做 transfection 以後, 晚一點再收細胞. 讓
基因有充足的時間表現.
3. Transfect 到高表達的細胞株試試, 比如 HEK293T 細胞.
Good luck!
※ 引述《anchi35 ( )》之銘言：
: 請問各位高手
: 目前在進行flag-tagged protein的實驗
: 實驗大致如下
: 質體以superfect送入到PC3 cell 養overnight
: 將細胞lyse後15000rpm 離心20min 取上清液
: Control組 : PC3 cell lysate only
: 實驗組 : Flag-tagged protein 1 75kDa (我主要在測試的)
: Flag-tagged protein 2 20kDa (實驗室學姊的,這組算是用來測試transfection
: 是否成功)
: 做western
: 用的抗體是Sigma Monoclonal ANTI-FLAG M2 monoclone antibody 1:500
: 結果出現一些雜band (control組也有)
: protein 2有大量表現
: protein 1則沒有
: 可是比較3組 扣除都有出現的雜band
: Flag-tagged protein 1那組有多出兩條約40-50kDa大小的band
: 請問這有可能是protein 1 degrade?
: 還是也只是雜band 而我要的protein 1根本不表現
: 如果是根本不表現 請問可能原因為何?
: 該如何使它表現?
: 謝謝各位的回答及指教
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