[求救] inverse-PCR完全沒有東西@@
我最近在做inverse PCR, 想嘗試用這個方式將一個gene的未知序列p出來
gene的大小約2.4kb, 中間1.2kb的序列已知, 之前是用degenerate primer p出來的.
已經連續p兩個禮拜了, 調整過不同的PCR condition, 結果都完全沒有band
想請教板上的各位, 可能是哪裡出問題了?
以下是我的protocol:
1. 3ug genomic DNA digestion (50ml reaction), 37度C, O/N
2. Heat inactivate之後, 直接取出3.5ul or 7ul (約0.2ug/0.4ug DNA)來進行ligation,
ligase濃度400U, in a 100 ml reaction. 15度C, O/N
3. 用PCR extraction kit將ligated DNA純化
4. PCR reaction:
denaturing 94C 1 min
annealing 50~58C 1 min
extention 72C 3~10min
DNA的量大約40~80ng,
annealing temp.我試了50,55,58C
extention time試了3, 5, 10min
跑出來都完全沒東西@@"
primer都是31bp, 前面有加restriction site, 實際和template結合的有22bp,
Tm大概是64~66度.
因為懷疑是不是primer有問題
我拿之前p出1.2kp中間序列的degenerate primer, 和我的primer交叉來跑PCR
可以p出東西, 位置也沒錯.
所以現在不曉得是哪個步驟出了問題@@"
拜託有經驗的人提供意見, 謝謝:)
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