Re: [求救] inverse-PCR完全沒有東西@@

看板Biotech (生命科學)作者yaliu (雅)時間18年前 (2008/05/11 15:47)推噓0(0推 0噓 0→)

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最近也一直在iPCR裡摸索@@ 不過我可以提供我的經驗給你因為我曾經很幸運的成功了一次雖然另一個像鬼打牆一樣只出來給我看過一次弱弱的band後就在也不出來了Q_Q ※ 引述《pocheng0227 ()》之銘言： : 我最近在做inverse PCR, 想嘗試用這個方式將一個gene的未知序列p出來 : gene的大小約2.4kb, 中間1.2kb的序列已知, 之前是用degenerate primer p出來的. : 已經連續p兩個禮拜了, 調整過不同的PCR condition, 結果都完全沒有band : 想請教板上的各位, 可能是哪裡出問題了? : 以下是我的protocol: : 1. 3ug genomic DNA digestion (50ml reaction), 37度C, O/N : 2. Heat inactivate之後, 直接取出3.5ul or 7ul (約0.2ug/0.4ug DNA)來進行ligation, : ligase濃度400U, in a 100 ml reaction. 15度C, O/N 基本上我有先做南方雜和，看看目標基因位置落在哪裡，切膠純化（至少縮小了範圍）當然我會再PCR一次check我要的基因有沒有被我純化出來如果你不想切膠純化的話，至少digest後的DNA要先純化才去做ligation 一般我做ligation體積不會用那麼大我都做10ul，頂多最高到20ul(我想說體積太大或許不好碰撞吧，我是這麼覺得的啦) : 3. 用PCR extraction kit將ligated DNA純化我沒純化就直接去P了 : 4. PCR reaction: : denaturing 94C 1 min : annealing 50~58C 1 min : extention 72C 3~10min : DNA的量大約40~80ng, : annealing temp.我試了50,55,58C : extention time試了3, 5, 10min : 跑出來都完全沒東西@@" 另外，我想問的是你選用的限制酵素應該有注意到在你已經放大出的片段裡面找不到他吧！？我建議還是要做一下南方看看你切完後含目標基因的DNA片段到底有多大會比較好控制你PCR條件 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.115.79.163