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[求救] 有關gel shift assay的問題

看板Biotech (生命科學)作者 (蝶)時間17年前 (2008/09/03 12:08), 編輯推噓4(4推 0噓 12→)
留言16則, 6人參與, 7年前最新討論串1/1
想請問一下 我們LAB想看CENP-B跟HeLa cell的核蛋白有無interaction 之前好像有clone CENP-B的片段，然後transfection送到HeLa cell中 從fish的data上看，似乎是有interaction，想在利用gel shift 佐證 老師告訴我的方法，就是抽HeLa的核蛋白，然後把之前transfection的clone dna跟 核蛋白作用，然後跑1% agarose gel，在用EtBr染色，如果蛋白跟dna有interaction 就會shift上去。 發現出來的DATA，整個lane是smear, 如果是DNA only或是protein only的lane則不會 看到smear的現像， 這樣的data是表示 protein跟dna有interaction嗎?? 請問一下，這樣的方法可行嗎 看paper都是跑acrylamide gel，dna也有經過biotin或放射線lable， 我們的這個方法，有沒有問題呀~~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.65.234
推
09/03 12:51, , 1F
EMSA不是還要用Ab確認蛋白- -?
09/03 12:51, 1F
※ 編輯: sdshow 來自: 140.128.65.234 (09/03 13:49)
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09/03 13:52, , 2F
我這個應該不用吧，我是知道有人在DNA上lable biotin，然後
09/03 13:52, 2F
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09/03 13:53, , 3F
用HRP呈色看結果，沒用到Ab耶
09/03 13:53, 3F
推
09/03 15:38, , 4F
這應該算是gel shift的結果了吧,因為你並不知道他會怎樣與
09/03 15:38, 4F
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09/03 15:39, , 5F
DNA纏繞,所以只能知道有shift,而不一定是較高或是較低的band
09/03 15:39, 5F
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09/03 15:40, , 6F
記得要附上DNA only與 protein only的圖
09/03 15:40, 6F
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09/03 15:42, , 7F
不過你要不要拿不會binding的DNA與你的核蛋白作用跑跑看?
09/03 15:42, 7F
推
09/03 16:42, , 8F
實驗沒有postive con.的話,說這smear現象為shift是會被釘的
09/03 16:42, 8F
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09/03 16:45, , 9F
此外若沒有排除核內nuclease干擾我會推測smear是被切碎造成
09/03 16:45, 9F
推
09/03 22:47, , 10F
記得要有一個DNA+BSA的negative control，另外，如果蛋白
09/03 22:47, 10F
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09/03 22:48, , 11F
質夠多的話，多加一點應該結果會更漂亮（如果可以逼近飽和
09/03 22:48, 11F
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09/03 22:49, , 12F
smear通常是DNA跟蛋白質binding的位置不只一個所造成，當然
09/03 22:49, 12F
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09/03 22:50, , 13F
這便暫時先不考慮樓上b網友所說nuclease的作用，如果使用
09/03 22:50, 13F
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09/03 22:51, , 14F
oligo nucleotide進行EMSA，多半都只會有一個shift的片段
09/03 22:51, 14F
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11/11 00:57, , 15F
用HRP呈色看結果，沒 https://muxiv.com
11/11 00:57, 15F
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01/03 16:44, 7年前 , 16F
oligo nucle https://muxiv.com
01/03 16:44, 16F
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