[求救] western的internal control 調不勻

看板Biotech (生命科學)作者katty7389 (被風吹跑了~)時間16年前 (2009/11/10 10:24)推噓2(2推 0噓 3→)

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大家好我是做western blotting的新手最近實驗遇到瓶頸.想請大家幫忙最近我在做KB跟L30 protein的表現可是發現每次壓出來的internal control都不均勻 (我有分fraction, cytoplasm是壓b-tubulin. nucleus是壓lamin B) 我猜想幾個可能造成的原因 1.收細胞時,medium去除不乾淨影響定量的結果 2.收細胞時兩個細胞收的量不太一樣影響定量結果 3.因為我把sample跟sample buffer加在一起之後去加熱.在loading到SDS-PAGE 時發現體積會比原本兩者混在一起的體積還少.我覺得自己使用pipette的技術沒有問題.我在想會不會是這個環節有問題因為只是猜測不確定是哪邊出了問題不過因為問題沒有解決我有點害怕進行下一個實驗所以想請大家幫我看看這邊附上我收細胞到loading sample的流程請大家幫我指正１。用trypsin打下細胞。離心１２０００rpm 去除medium再用PBS wash一次２。離心　去除PBS 3.用０.4M LYSIS buffer I與cell pellet mix ４。on ice 15 min 5.加入10%np40 votex後離心13000rpm 取上清液即為cytoplasmic extract 6.加入lysis buffer II與cell pellet mix ７。１５分鐘內　約每１分鐘vortex　１０秒８。離心13000rpm 取上清液即為nucleus extract 9.將取得的sample做定量１０。定量的結果假設為２.４１μg/μl,我每個well想loading 40μg.就加１６。５μl的sample與４μl　６x的sample buffer混勻(無論多少sample 　　　　　都加４μl的sample buffer)　 11.100度煮protein 10分鐘１２。loading sample 有錯麻煩大家指正　謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.139