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[求救] 西方墨點測試蛋白的合成

看板Biotech (生命科學)作者 (梅子)時間16年前 (2009/06/28 11:59), 編輯推噓7(7推 0噓 9→)
留言16則, 6人參與, 7年前最新討論串1/2 (看更多)
我是將所要的(從染色體DNA PCR來的)基因接在一表現載體上用大腸桿菌表現其蛋白 將純化到的蛋白打老鼠收集多株抗體 收到的血清進行西方墨點法! 抗體的效價 稀釋至1/2000 還可以有很明顯的 辨認效果 現在我要直接將這抗體 辨認直接取自(真菌) 菌體培養後產生的蛋白 理論上 應該可以辨認到 但是沒有 因為我有另再從RNA去進行RT-PCR 也可以得到同樣的基因片段 DNA會轉錄成RNA 那應該也會合成出蛋白質 還是說 不一定?? 麻煩大家幫我解答一下囉!謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.130.38.65
推
06/28 12:36, , 1F
接cDNA比較正確吧...
06/28 12:36, 1F
喔!我的策略是有各別從染色體DNA及cDNA進行基因選殖..
推
06/28 13:06, , 2F
第一行是用什麼系統表現蛋白去免疫老鼠?
06/28 13:06, 2F
大腸桿菌表達的!!
推
06/28 14:42, , 3F
你當初打老鼠前的蛋白怎麼純化的
06/28 14:42, 3F
→
06/28 14:42, , 4F
難道跟你後面用菌表現的不一樣
06/28 14:42, 4F
→
06/28 14:43, , 5F
最後你可以用菌表現的蛋白 去做抗體
06/28 14:43, 5F
打老鼠的蛋白是從大腸桿菌表現後用His-tag 管柱純化， 去辨認同樣表現自大腸桿菌的蛋白可以辨認到 但去表現本身真菌的蛋白認不到
推
06/28 19:20, , 6F
測titer和你最後western要用得應該是同一種才對吧
06/28 19:20, 6F
推
06/28 19:23, , 7F
假設你先用酵母菌表現的去免疫 後來用E.coli表現
06/28 19:23, 7F
→
06/28 19:24, , 8F
然後你的蛋白又需要轉譯後修飾 那就可能認不到啦
06/28 19:24, 8F
恩~我是剛好反過來 我是用E.coli表現的蛋白去免疫 ，去辨認真菌的蛋白 表現系統不一樣 了解會有認不到的可能性 可是我cDNA可以得到相同的片段..應該可說是 此基因會進行轉錄 ※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (06/30 10:02) ※ 編輯: bbiioo 來自: 140.130.38.65 (06/30 10:05)
推
06/30 16:44, , 9F
會轉錄和轉譯後修飾是兩回事吧? 假設說這是個醣蛋白
06/30 16:44, 9F
→
06/30 16:44, , 10F
你用E.coli表現他的folding就不對了 之後真菌表現的
06/30 16:44, 10F
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06/30 16:45, , 11F
有醣基化的話 可能就把你原本會辨識的epitope蓋住了
06/30 16:45, 11F
推
06/30 16:49, , 12F
拿你的胺基酸序列去預測一下epitope和轉譯後修飾位置
06/30 16:49, 12F
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07/01 00:24, , 13F
..恩~了解 那再問一下..要預測 可以去哪測?(網站)
07/01 00:24, 13F
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07/01 00:24, , 14F
還是說 我手上有DNA Star這套軟體 他可以作這預測嗎?謝謝
07/01 00:24, 14F
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11/11 01:33, , 15F
有醣基化的話 可能就把 https://noxiv.com
11/11 01:33, 15F
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01/03 16:56, 7年前 , 16F
假設你先用酵母菌表現的 https://daxiv.com
01/03 16:56, 16F
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