Re: [求救] PCR結果定序出來的序列不是我要的!!
首先要問你pcr產物多長
跟你預設的結果長度相同嗎? 不同也不用玩了
通常>500bp以上，會建議送2端去定序 (因為一般極限為7-800bp)
forward primer 訂序結果直接用
reverse primer 定序結果要先reverse & complement
通常中間會有重複的 可以合併起來
如果長度適當 forward primer的結果會看到 reverse primer 的序列
reverse primer定序結果會看到 forward primer 的序列
互相比對一下就可以得到全長了
ps 如果產物很長 可以在中間加一primer去訂序
通常都是接到vector上後再用vector上已知的primer去定序，
這樣才能看到pcr用的primer序列。
假如這樣你都比不出來 我只能說
你真的pcr到路人甲了，primer特異性不夠。
※ 引述《mini188 (迷你邀霸罷)》之銘言：
各位好
我之前PCR跑出一段序列後 送去定序
我將原來primer和定序結果blast 但是沒有相似的地方
於是我將序列reverse 也不行
我又將序列 reverse & complement 也不行
用了forward 和 reverse的 primer 都沒對到
定序的PEAK很漂亮沒問題
那請問各位 為啥之前我的PCR可以做出很shape的band?
annealing temp 是60度 應該不至於會有non-specific的問題吧?
不知道是定序方面出問題還是我的PCR出問題
但若是PCR有問題 那之前跑出的band是什麼東東??
不知道大家有什麼想法?? 謝謝!
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