Re: [求救] 如何從未知序列篩選出興趣片段
※ 引述《nau9231 (nau9231)》之銘言：
: 我拿到一個新的嗜熱菌菌種。
: 我用快篩知道它裡面酯解酵素(esterase)有很好的效果!!
: 可是它是新的菌種,基因序列都還未被定序出來。也就是說它是一個未知的序列。
: 所以現在我不知道要如何取我感興趣的基因片段( 酯解酵素 )。
: 用限制?酵素去切嗎??
: 可是限制?酵素必須知道自己的基因序列才可以知道用哪種限制?去切。。
: 可以給我一些建議嗎??我該如何把我要的基因片段拿出來呢!!
是要將基因放大出來放到別的物種表現這個蛋白質嗎？？
如果你想知道這個序列長相，唯有將這段基因選殖出來
要作到表現，可能就要需要完整的基因序列
基因的選殖個人認為很靠運氣啦～下面跟你說有哪些方法可以知道
首先當然就是要先到NCBI搜尋相似物種蛋白質之胺基酸序列，
多找幾個，再進行alignment，當然物種蛋白越相似越好
再來針對conserve region設計degenerate primer
再PCR放大部份片段（template是chromosome）
再來呢，將這個片段定序後得到此基因部份序列的長相
接著，以不同限制酵素切割你的chromosome
接下來你有兩種選擇
1. inverse PCR
2. 小範圍的genomic library: southern hybridization -->部份純化-->cloning--->
colony hybridization 或一個一個挑起來check (by PCR...)
如果此酵素表現後，有很快速的方法可以知道他的存在
那麼clone就會比較好挑
以上是我知道的方法
若有更簡單的方法請版友補充 XD
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