Re: [求救] 蛋白質濃度定量 for SDS-PAGE

看板Biotech (生命科學)作者sharkcell (我好想念妳，Chic)時間16年前 (2009/10/11 02:41)推噓4(4推 0噓 5→)

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※ 引述《pent (情人去死)》之銘言： : 抱歉，問個笨問題 : bradford assay測濃度，BSA建standard curve : duplicate,96-well plate : sample 10ul+ 190 bradford reagent : reagent 5倍稀釋 : (mg/ml) : sample OD1 OD2 average : 1 1.0329 1.0275 1.0302 : 0.5 0.7091 0.714 0.71155 : 0.25 0.3947 0.439 0.41685 : 0.125 0.209 0.2159 0.21245 : 0.0625 0.0833 0.0659 0.0746 ^^^^^^^^^^ 你都是2倍稀釋，中間應該穿插個其他質數倍數的稀釋，像是3倍或5倍 : Blank 0.0034 -0.0034 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Blank是什麼？空的還是有加buffer？目前我做過的實驗吸光值是沒有負值的，所以我也採用基本上我會建議Blank要放等體積的Buffer去和Bradford混合而非單純只加Bradford，甚至是什麼都不加以你的實驗而言就是10uL sample buffer + 190uL Bradford 我幫你利用你的數值重新算過一次看圖的感覺是濃度1已經飽和了這也是Bradford常有的問題，濃度1對他而言濃度太高，會低估所以我將濃度1的這個點去除不拿來作為曲線的參考值結果為：y = 1.4199x + 0.0211 R平方=0.9849 : 100倍稀釋 : sample average conc. : IP 0.0134 0.0118 0.0126 -7.136746 : before 0.0326 0.035 0.0338 -5.095398 : A 0.101 0.1 0.1005 1.327145 : B 0.0675 0.0707 0.0691 -1.696361 : 趨勢線的公式：y=0.9629x-0.0835 r square>0.95 ^^^^^^^^^^^^^ 第一點，也是很重要的一個基礎點，r平方值要大於0.99 其實你的技術還不差但還需要再以加熟練但因為你的1/4跟1/16的二重覆相差頗大我以人工選擇的方式利用以下數據作曲線 Standard OD1 OD2 AV 1/2 0.71155 1/4 0.3947 1/8 0.21245 1/16 0.0833 得到結果為：y = 1.4035x + 0.0216 R平方=0.9931 雖然得到漂亮的數值，但是參考的點數太少，基本上還是建議你重做這個人工篩選是很不得已的情況才做，畢竟是一個很主觀的作法不符合實驗需要"客觀"的研究跟探討的態度第二點，以你的結果數據來看，100倍稀釋太多了 (為什麼會說"你的數據"是因為你的算法) 濃度一旦出現負值，一定是你稀釋過度這是一個觀念，得到負值時要注意但是，如果以我幫你重新作出來的數據來算的話結果如下 Sample Av.OD Conc. A 0.1005 5.621660135 B 0.0691 3.384396152 就都是正值啦!! 看起來雖然有數據好像可以使用，但是因為你只有做一個稀釋這樣的數據並不可靠，你應該做個其他稀釋倍數然後取平均值例如：1/20，1/30，1/50等等 (建議不要做連續稀釋，要分開稀釋不同倍數) 另外，B樣品吸光值由於不落在我做出來區線的吸光值內也就是說我的曲線吸光值可用區在：0.71155~0.0833 所以不能保證B樣品的濃度可信任，總言之：我算出來的結果，A樣品的濃度可信度比B樣品高 : 1.想請問因為我IP完後，濃度反而低於IP前，是不是我那一步錯誤， : 這樣正常嗎？做IP濃度變低是正常的畢竟妳去除了一些你不要的蛋白質加上沉澱再回溶的步驟一定也會有所損失除非你有做很高倍的濃縮，不然IP只是幫你做類似純化的步驟 : 2.bradford assay測的濃度可以在低嗎？我想建一條standard，濃度到0.0625mg/ml以下 : ，我剛抽出來的protein濃度太稀了，因為這是很重要的sample，又有點趕時間 standard curve的建議很重要但是如果你的樣品濃度太低我則建議不要稀釋樣品去測如果可以用BCA就用，個人認為效果比bradford來的精準另外濃度1對於BCA而言並不會飽和，反倒是濃度2才有機會過飽和 : 3.超級笨問題先將sample OD帶入趨勢線公式在乘回稀釋倍數， : 還是先將OD*diluent factor? 假設你的回歸公式為：y=ax+b 且一個稀釋N倍的樣品得到的吸光值為y 則樣品原始濃度為：N[(y-b)/a] 利用這個公式你就可以知道實際濃度N[(y-b)/a] 絕對不等於 (Ny-b)/a 所以說，稀釋倍數是最後再乘回去的 : 感激不盡<(_._)> 我建議最好還是重新作一遍蛋白質定量，別浪費這次抽出來的蛋白質雖然不敢保證我的想法一定全部正確，但可以互相討論加油~生技的未來要靠大家一起打拼T_T 想說這是一個很好的例子可以讓初學者學會試誤學習所以花了一些時間整理這個例子中出現的一些盲點讓原本整個數據好像完全不能採用的情況多一些參考價值以便下一次再做同樣實驗時可以知道該如何修改實驗的步驟原po應該還是初學者吧~可以多跟實驗室的學長姐們討論唷^O^ ※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:21) ※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:27) ※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:27)