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[求救] 高分子量的膜蛋白跑 SDS_PAGE

看板Biotech (生命科學)作者 ( o_o)時間16年前 (2009/11/24 12:04), 編輯推噓8(8推 0噓 30→)
留言38則, 7人參與, 7年前最新討論串1/2 (看更多)
我要看的蛋白在膜上 大小是170-190 這是一個很長的故事= = 總之一開始壓片出來整個是白的 猜想是沒有transfer過去 所以我4。C transfer overnight 就看得到了 可是目前就是髒髒醜醜的 趨勢若有似無 有蠻多雜band... 我還寫信問抗體公司(cell signaling) 他給我的建議是 1.膜蛋白煮沸容易聚合(?) 叫我不要95度 5min 以60-70度15-20min代替 來處裡sample 2.並且用"牛奶"blocking 3.而抗體的稀釋建議以PBS 或TBS 就好 不要加BSA 跟 TWEEN20 可是看起來也是黑黑髒髒的 而且 要明顯的話 就要曝光好幾分鐘才看得到 但是曝光久背景值也好高 根本就很髒 如果我想拉開點(已經用到6% 的膠 跑50V 了喔= = ) band就會糊掉或歪掉 想直直的就會拉不開 囧 我剛剛爬了許多文 發現有人建議大分子量的蛋白在transfer時 transfer buffer 可以加0.1%的SDS 而methenol則由20降到10% 以及乾脆用全細胞跑 以免離心後膜蛋白所剩無幾 (我試過一次 覺得蛋白質定量好像會誤差很大 而且loading時很糊很黏根本load不下去) 想請教各位大大 覺得如果我這樣處理DATA會不會好一些 我已經鬼打牆一個多月了 現在剩不到一個月可以補DATA 阿阿阿 一定要跑出一個漂亮一點的圖啊Orz 麻煩大家給我一點意見吧 >_< 謝謝Orz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.223.184 ※ 編輯: ATPase 來自: 140.109.223.184 (11/24 12:13)
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11/24 13:37, , 1F
我有一樣的問題 也是問cell signaling 但是他們給我的建
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11/24 13:38, , 2F
意是用sonication破壞膜結構 你可以試看看 我還沒試
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11/24 13:38, , 3F
我是看E-cadherin 135kd
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11/24 13:39, , 4F
不然就是我最近在思考在lysis buffer裡面加triton x100
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11/24 13:40, , 5F
因為我做con-focal的sample preparation會用此來permeabl
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11/24 13:41, , 6F
ize膜我當時有跟support講不過他們還是說sonication最好
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11/24 14:03, , 7F
E-cadherin我有做過耶 其實不用sonicate 我都是刮完細胞
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11/24 14:03, , 8F
裝進各管後 votex久一點 就OK了
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11/24 14:04, , 9F
不過lysis buffer可以換強一點的 detergent多一點的
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11/24 14:05, , 10F
甚至用10% gel 跑久一點都還可以 不過用8%也許比較好
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推
11/24 14:07, , 11F
我曾經聽樓上的postdoc說膜蛋白有些要用專門kit
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11/24 14:13, , 12F
我找的一些paper裡也有這樣說耶 好像是要enrich膜蛋白用的
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推
11/24 14:45, , 13F
借題問一下，如果跑出來髒的話不是表示non-specific
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11/24 14:45, , 14F
binding多嗎？為什麼反而把稀釋抗體的BSA和detergent拿
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11/24 14:46, , 15F
掉呢？這樣不是應該會使band更髒嗎…
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11/24 14:54, , 16F
這個問題我也想過= = 因為我是壓片壓很久搞的背景高的要死
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11/24 14:56, , 17F
也許他是希望signal強一點 再讓我洗久一點吧Orz(誤)
11/24 14:56, 17F
推
11/24 22:06, , 18F
哈~我做的東西就是樓上耶,我確定有純化膜的kit,不過我沒買
11/24 22:06, 18F
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11/24 22:08, , 19F
我的建議是lysis後冰-80一陣子再離心,還有transfer久一點
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11/24 22:08, , 20F
之前做一個蛋白質分子量大概也是170,要比另外兩個100左右
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11/24 22:09, , 21F
多transfer5分鐘(semi-dry,biorad)
11/24 22:09, 21F
推
11/24 22:11, , 22F
另外我抗體稀釋也不加detergent,wash才用PBST,背景值都OK
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ps.我們LAB是取組織,萃取用sonicator震到不見組織為止
11/24 22:13, 23F
推
11/25 02:45, , 24F
髒不代表non-specific binding多 可能是你signal太低
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11/25 02:45, , 25F
所以背景看起來很強 原因可能很多種
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推
11/25 10:37, , 26F
我們實驗室跑ABCA1是不加熱 直接跑 一加熱就掛..
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11/25 11:20, , 27F
一加熱就掛是指說會變超髒嗎><
11/25 11:20, 27F
推
11/25 22:03, , 28F
我們家也有一隻不能加熱的,加熱之後會染到很多條band
11/25 22:03, 28F
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11/25 22:04, , 29F
直接加dye靜置5-10分鐘就load了
11/25 22:04, 29F
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11/25 22:05, , 30F
不能加熱的是hb的sodium pump
11/25 22:05, 30F
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11/26 19:25, , 31F
那....你們有在dye跟running buffer裡多加SDS嗎???
11/26 19:25, 31F
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11/26 19:26, , 32F
還是用原本的配方 只是不加熱???
11/26 19:26, 32F
推
11/27 08:09, , 33F
配方都一樣就是不加熱而以, 膜蛋白是很神其很詭異的..
11/27 08:09, 33F
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11/27 08:09, , 34F
原PO加油吧...
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11/28 13:53, , 35F
感謝.... 我會試試看的Orz
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12/09 00:00, , 36F
也許你需要native page 查查吧
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11/11 01:51, , 37F
直接加dye靜置5-1 https://muxiv.com
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01/03 17:03, 7年前 , 38F
我們實驗室跑ABCA1 http://yofuk.com
01/03 17:03, 38F
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