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[求救] Pichia pastoris系統表現蛋白

看板Biotech (生命科學)作者 (孟克的吶喊)時間16年前 (2009/11/25 15:41), 編輯推噓4(4推 0噓 11→)
留言15則, 4人參與, 7年前最新討論串1/2 (看更多)
大家好， 我目前在使用pichia pastoris表現系統表現病毒蛋白， 使用的vector是pGAPZa加上SMD1168 stain的酵母菌， 電穿孔後有挑到能生長在高抗生素的培養基上(Zeocin 2000ug/ml)， 但拿來表現蛋白後，不論是取100倍濃縮的上清液或是用玻璃珠打pellet， Westen blot都偵測不到。 培養條件是30度，270rpm搖兩到三天， 收取上清液濃縮100倍， Flask是燒凹角的三角錐形瓶(增加震盪)， 不知道有沒有在做相關研究的板友， 可站內信討論，相當感激!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.109.67
推
11/26 12:43, , 1F
請問你用的培養基是...? 還有western的抗體是...?
11/26 12:43, 1F
推
11/26 16:42, , 2F
質體上有確實接到基因嗎?有可能選到空質體的菌種
11/26 16:42, 2F
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11/26 18:44, , 3F
我用的是YPD培養基，Westen 抗體用Anti-HIS 或myc下去認
11/26 18:44, 3F
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11/26 18:45, , 4F
跑Westen前都有用colony PCR篩過，都有insert進去，但不知
11/26 18:45, 4F
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11/26 18:46, , 5F
道為什麼，到產蛋白就卡住了>_<"
11/26 18:46, 5F
推
11/28 17:06, , 6F
果然阿...甲醇誘導的時候如果培養基裡有glucose會抑
11/28 17:06, 6F
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11/28 17:07, , 7F
制AOXp啟動下游基因表現 建議你誘導時置換成YPM
11/28 17:07, 7F
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11/28 17:08, , 8F
然後你可以去看一本書 Pichia Protocol 對實驗有幫助
11/28 17:08, 8F
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11/30 20:26, , 9F
感謝建議，不過我用的是pGAPZ的載體，應該是不需要甲醇
11/30 20:26, 9F
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11/30 20:28, , 10F
下去誘導的，這個載體是使用GAP為起動子。
11/30 20:28, 10F
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11/30 20:31, , 11F
但適用哪一種培養基適合產蛋白這我的確不大清楚，我再試試
11/30 20:31, 11F
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11/30 20:31, , 12F
看，謝謝!
11/30 20:31, 12F
推
12/02 00:35, , 13F
抱歉我眼花了 @@
12/02 00:35, 13F
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11/11 01:51, , 14F
下去誘導的，這個載體是 https://noxiv.com
11/11 01:51, 14F
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01/03 17:03, 7年前 , 15F
果然阿...甲醇誘導的 http://yofuk.com
01/03 17:03, 15F
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