[求救] 放大cDNA的一些問題
因為最近要幫老師做專題遇到了一些問題...
有蠻多不懂的地方想請教一下板友
就是該實驗最後要用real time PCR 去定量看gene的表現量
而事前要將抽RNA後轉成cDNA 再拿cDNA去做real time
我們實驗室是用Trizol去抽...
照理說抽出來的應該是細胞內所有的RNA (包含mRNA rRNA)
而後用OligodT去轉cDNA ←應該是所有細胞中的mRNA都會被轉成cDNA對吧?
之後就將cDNA拿去用待測gene的primer去夾用PCR放大
因為目前還不知道要挑哪些gene出來測
所以我們BOSS是說
先把RNA抽出送去做PCR array再從中挑幾個用real time去檢測是否符合
我們BOSS說每個濃度只要做一管轉成cDNA就好
之後的real time都可以用那管去做
我的疑問是...今天待測基因約有5個
而且要做3重複 如果都從那管有整個細胞的mRNA轉成的cDNA取出 應該會不夠
那如果要將該管cDNA用PCR放大
那primer要怎麼辦? 因為你不知道那管cDNA的組成 那你要怎麼去放大全部的片段?
還有一個問題...就是我可以先把加藥處理完的細胞都抽RNA轉成cDNA
那以後就可以不用再養細胞 而只要從那管cDNA去做就好 這樣嗎 ??
這是第一次做PCR所以有很都不懂的地方...請大家幫忙看一下是否觀念有錯
謝謝^^
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◆ From: 114.39.3.19
※ 編輯: wayne841503 來自: 114.39.3.19 (01/30 00:18)
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剛剛去看了些資料還是有些地方不太懂
關於這實驗的設計是用同樣濃度的藥物不同的處理時間
來看藥物對細胞的傷害
有做了2hr 12hr 24hr三個時間點 每個時間點都有一個negative control
要去看不同的處理時間中 所選出的5個基因表現量是否與PCR array的趨勢相同
就拿2hr的來說好了...一管是有加藥 另一管是沒加藥
拿加藥那管來看 去抽RNA 所抽出來的不是total RNA嗎? 之後再用oligodT去轉cDNA
所轉出的應該是total mRNA吧?
也就是說那管cDNA中包含著
1.因藥物處理導致A gene表現產生的mRNA (先把待測gene當成A) 所反轉成的cDNA
2.原本就存在的mRNA 經反轉成的cDNA
是這樣嗎??
如果是的話...因為到時候可能要測到5個gene
我是怕先前抽的mRNA轉成cDNA後那管的量不夠用來測5個gene
之後是設計A gene的primer 拿去跑real time
用sybr green 去測A gene與housekeeping的表現量 來做相對定量
在去比較有加藥與未加藥兩管中 A gene是否有明顯上升這邊還有個疑問...剛剛去查了
RT-PCR
它可以把mRNA轉成cDNA ←但這不是ssDNA嗎?
還有protocal上 RT-PCR不像一般的PCR有denature→annealing→elongation 循環放大
那該不會一條A gene所產生的mRNA 只會轉成1條cDNA吧?
2條mRNA就轉出2條cDNA
那這樣的cDNA數不就等於你當時加下去RT-PCR前的mRNA量?
這邊看了protocal與資料後還是不懂...
如果是這樣的話我抽出RNA的total濃度約2ug/ul 260/280=1.93 共約30ul而已(每管)
那之後轉成cDNA不就也是那些量而已?
也就是說我到時候要養到5盤cell 轉5管cDNA 再分別拿去跑real time測各gene表現量這
樣嗎? ←BOSS跟我說只要每個時間點抽一管就可以測5個 但我不太懂他的意思
我一直覺得一管才20~30ul又要做到5個gene會不夠
麻煩幫我看一下...是不是我有想錯哪部分或是哪部分觀念有誤
目前一直卡在這邊轉不過=口=
拜託了> <
※ 編輯: wayne841503 來自: 114.39.10.71 (01/30 16:11)
※ 編輯: wayne841503 來自: 114.39.10.71 (01/30 16:12)
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