Re: [求救] 關於GFP transfection
※ 引述《anchi.bbs@ptt.cc (我家有隻可愛小都)》之銘言：
> 最近做了transfection,
> 用lipofectamine transfect 一個帶有GFP的plasmid,
> transfect完隔兩天,螢光顯微鏡下看到有發綠色螢光的細胞約50%,
> 之後我就繼續用加了G418的medium篩, (plasmid上有neomycine resistance gene)
> 細胞持續養了兩個禮拜, 可是這段期間有綠色螢光的亮點卻越來越少,
> 今天看大約只剩10~20%了.
> 細胞的型態都正常,存活數量也持續增多,
> 抗生素的濃度我是參考過許多相關paper的濃度.
> 到底是甚麼原因呢?
> 以下是我的想法,若有觀念錯誤請大家指證:
> 我的plasmid上是用CMV promoter,
> 照理說,GFP gene在真核細胞內應該會持續被活化表現,
> 細胞內應該一直會有GFP protein.
> 所以若細胞有這個plasmid, 應該會持續散發綠色螢光.
> 那麼在抗生素篩選下,細胞數量也有增多,為何發螢光的細胞數量越來越少呢?
> 請大家指點我是否有觀念錯誤,
> 謝謝! :)
可以請問你G418的濃度你有自己做過killing curve嗎?
因為每種細胞每個人養起來不同 參考paper是用來抓約略範圍的
聽起來你的細胞是生長很快的那種 我之前也遇過類似問題
在測killing curve後 你可以挑選你希望殺死細胞的天數的G418濃度
一般作stable clone會挑選10天殺死細胞的抗生素濃度
我想你可以挑選早一點(例如7天)殺死細胞的抗生素濃度
另外 還要注意細胞滿度 細胞過滿時對抗生素不敏感
--
※ Origin: 交大次世代(bs2.to)
◆ From: 140.116.194.55
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