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[求救] transformation的問題

看板Biotech (生命科學)作者 ( )時間16年前 (2010/02/07 15:30), 編輯推噓4(4推 0噓 5→)
留言9則, 6人參與, 最新討論串7/8 (看更多)
請問一下各位大大 小弟我最近作transformation有遇到一些問題 這實驗在重複實驗下 一只出現相同的問題 就是我將vector(pet21b≒5 kb) + insert (≒0.6 kb)載入competent cell (DH5a) 塗plate overnight 只有一個colony 然後我在去挖出來LB培養 之後有再用抽取plasmid 確定是否有ligation成功 可是跑出來的電泳膠片(0.7%) 只有約3 kb insert 來源從膠片回收與 PCR得到 insert 電泳測試皆為0.6kb 最後都得到的plasmid結果band (3kb) 若是vector沒切乾淨的話 應該至少也要有5.X kb吧?! 已經卡關卡了好久都是一樣的結果 所以想要請問各位前輩 是我的plasmid 不適合DH5a嗎? 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.113.77.200 ※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (02/07 15:32) ※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (02/07 15:34)
推
02/07 15:50, , 1F
建議先linearize plasmid後，再估計大小會比較準確
02/07 15:50, 1F
→
02/07 16:06, , 2F
如果沒有linearize的話 不是只會差1kb左右嗎?
02/07 16:06, 2F
※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (02/07 16:07)
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02/07 17:56, , 3F
我認為supercoil form程度不同 就會得到不同結果 建議切一
02/07 17:56, 3F
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02/07 17:57, , 4F
刀
02/07 17:57, 4F
推
02/07 18:16, , 5F
建議你去找附近cloning作得很順的人仔細討論你的實驗
02/07 18:16, 5F
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02/07 18:18, , 6F
cloning失敗 每個步驟都可能有問題
02/07 18:18, 6F
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02/07 18:19, , 7F
trouble shooting對新手來說蠻難的 別害羞直接去找人討論吧
02/07 18:19, 7F
推
02/07 20:17, , 8F
其實也可以直接PCR來看 看circular form真的不準
02/07 20:17, 8F
推
02/07 21:18, , 9F
只有一個colony很有可能只是雜菌..
02/07 21:18, 9F
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