[求救] pichia pastoris X-33 transformation
請問各位
我目前在做pPICZaC分別插入三段片段 轉殖到P. pastoris X-33
先使用PmeI去切線性質體(需要clean up嗎?)
升任細胞製作是培養3ml YPD overnight 30度 250rpm
在隔天取100ul接種到100ml YPD約八小時長到OD600 1.3~1.5 (時間會不會太短?)
6000rpm離心去培養基
冰無菌水100ml重新懸浮5000 rpm離心
在使用50ml無菌水+4ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心
在使用20ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心
最後用200ul 1M sorbitol回溶得到勝任細胞
再把切好的質體10ul+80ul勝任細胞混勻 冰上5分鐘
1500V 15uF 335電阻 電擊
加入1ml 1M sorbitol放30度1.5小時
塗YPDS plate 100ug/ml Zeocin
養兩天挑菌
抽genomic DNA
用5'AOX1 3'AOX1 primer PCR
95度4 min 1cycle; 94 60sec, 55 60sec, 72 150sec 34cycle; 72 10min 1 cycle
結果都只有P到菌體本身的AOX1 gene沒有轉入的基因
請問哪裡有問題
有研究的大大 幫忙指證一下 謝謝!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.106
※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (03/03 13:01)
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