Re: [求救] RT-PCR有產物,但Real time PCR沒有產物
※ 引述《itsmormon (...)》之銘言：
: 第一次來貴版拜訪 (因為我已經快發瘋了)
: 請多多指教 並救救我（跪求）
: 我要偵測處理胚胎後 特定基因的表現量
: 因此用roche的軟體設計real time 的primer
: 這對primer在RT-PCR已經有產物 並且送定序確認過了
: 因此要以real time PCR做定量
: 但是 我的產物大小為203bp control是已經insert產物的質體
: RT PCR條件為 cDNA濃度 50ng/ul
: 94度 1 min, 58度 40sec, 72度 20sec
: real time PCR條件為 cDNA濃度 200ng/ul<--sales建議5x dilute
: (因為50ng/ul 做不出來)
: 95度 10sec, 58度 20sec, 72度 20sec <---melting curve的peak和control一樣
: 但是電泳都沒有band 而是smear的樣子
: 40sec <---melting curve的peak比control低溫
: 電泳有2個band 一個在200多 一個在300多
: 請問接下來 我要修改哪個條件??
: 謝謝大家
你們RT 與 Real time 用的PCR應是不同台吧?
有種可能是二台的溫度校正不一樣 有些時候不同廠商的機器會有這種問題
另一個建議是Real time PCR用的Primer盡量使用新鮮的 不要用反覆冷凍的那種
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