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[求救]一些實驗上的問題

看板Biotech (生命科學)作者 (小小熱血生科人)時間15年前 (2010/06/06 19:45), 編輯推噓12(12推 0噓 25→)
留言37則, 11人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
先自介好了 小弟我是大二某生科系的學生 最近開始了生科系的實驗室人生~ 現在老師給我的課題是:cell culture => transfect(GFP) => western blot 做了半學期後 我對於一些實驗原理還不是很明白 所以想來求救板上的大大們~ ======================================================================= 一、作western blot時會用到SDS來使蛋白質依分子量分開，但同時也會讓蛋白質變性。 但蛋白質變性後，為何之後的一抗還能辨識目標蛋白質呢? 二、據我查到的資料，牛奶的目的是block membrane中的孔洞，這是什麼意思?? 如果沒有做這個步驟，最後的照出來的結果會怎麼樣子(重要 我想知道他會長怎樣)? 還有牛奶不可為加鈣的人工添加牛奶，如果加入了其他東西會怎樣? 三、transfect方式選擇? 我看過很多網路的資料，DEAE-dextran的介紹還蠻少的，是因為現在不常用了嗎? 還有liposome聽說效率較高，適用的細胞株也比較多對嗎? 他有什麼限制? 四、Western blot最後的ECL是怎麼讓蛋白質顯影在底片上的? 我知道底片是因為電子打在上面，使銀離子沉澱，但是什麼發散電子的? 顯影劑的作用又是什麼? 為什麼兩個容易加在一起才能使蛋白質顯影? 五、繼代培養中的EDTA是做什麼用的? 我知道EDTA能除去鈣離子、鎂離子，但為什麼要除去這兩個? 還有細胞培養時都是用D_PBS(去除鈣離子、鎂離子的PBS)為什麼? 細胞不需要鈣離子、鎂離子嗎? ======================================================== 大概就這些問題了，謝謝大大們解惑。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.137
推
06/06 19:50, , 1F
帶你的學長姐沒解釋?
06/06 19:50, 1F
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06/06 20:40, , 2F
有些有問過 像第一個問題但學長說不太清楚 我也查不太到
06/06 20:40, 2F
推
06/06 21:10, , 3F
抗體是辨認蛋白質的N端orC端上的特定序列 所以儘管蛋白質
06/06 21:10, 3F
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06/06 21:11, , 4F
已經變性被拉直了 但因為序列沒變 抗體還是能辨認到蛋白
06/06 21:11, 4F
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06/06 21:11, , 5F
上面的特定序列 進而bind在上面
06/06 21:11, 5F
推
06/06 21:45, , 6F
第二題,沒有blocking其實也不會怎樣,就是背景很髒而已
06/06 21:45, 6F
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06/06 21:51, , 7F
ECL是HRP的冷光受質,會發出化學冷光,使底片或影像系統感光
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06/06 21:53, , 8F
感光是感光,顯影是顯影,定影是定影 不一樣
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推
06/06 23:12, , 9F
第五題EDTA常和Trypsin一起當打下細胞的溶液.
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06/06 23:13, , 10F
相較於trypsin/HBSS，trypsin/EDTA會抓鈣離子，故會影響
06/06 23:13, 10F
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06/06 23:15, , 11F
某些細胞生長周期or貼附作用中需要用到鈣離子的情況
06/06 23:15, 11F
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06/06 23:17, , 12F
D_PBS我猜你是指DMEM/PBS，不同medium有不同的成分，適合
06/06 23:17, 12F
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06/06 23:18, , 13F
培養不同細胞，只是這樣而已，所以也有的細胞需要有鈣鎂的
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06/06 23:19, , 14F
D_PBS是最基礎的medium，
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06/06 23:29, , 15F
第一個問題跟MHC呈現蛋白 還有抗體的產生過成有關
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推
06/06 23:56, , 16F
DPBS不是medium,DPBS是一種PBS的配方,比較貴~D是Dulbecco's
06/06 23:56, 16F
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06/06 23:58, , 17F
一般而言用PBS替代也幾乎沒什麼差
06/06 23:58, 17F
推
06/07 00:01, , 18F
DMEM也不是最基礎的medium,如果medium用PBS泡鹽類應該偏高吧
06/07 00:01, 18F
推
06/07 00:01, , 19F
第一題的也要看那隻抗體的製造方式 看是使用完整的
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06/07 00:02, , 20F
蛋白去誘發抗體抑或合成特定的序列去做單株抗體
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06/07 00:02, , 21F
所以抗體的datasheet上才會寫適合用在哪種實驗
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06/07 00:04, , 22F
第二題把membrane擺成側邊看▃ ▃ ▃ ▃ ▃
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06/07 00:05, , 23F
凸起來的是轉過去的蛋白 凹槽則是well跟well之間的
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距離 要填補的孔洞就是指這 不過這也要看Ab好壞
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06/07 00:08, , 25F
第三題lipo效率高 不容易死亡(也視細胞株而定)
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而且可以包的DNA量有限制 還有其他transfect的方法
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06/07 00:09, , 27F
也在細胞死亡率 運送率 時間長短中玩翹翹板
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06/07 00:13, , 28F
第五題可以去查cell-cell junction中那兩個離子對
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06/07 00:18, , 29F
貼附蛋白的作用 或google EDTA,trypsin第一個就有
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推
06/07 01:58, , 30F
這些問題實驗室學長姐不知道...應該要檢討
06/07 01:58, 30F
推
06/07 05:06, , 31F
樓上~術業有專攻,有些東西不一定每個人都學過~且原po才大
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06/07 05:07, , 32F
二,他的學長姐搞不好才大三四而已~有些東西我也是到了研
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06/07 05:08, , 33F
究所才學會的~
06/07 05:08, 33F
推
06/07 08:01, , 34F
純推優良發問態度
06/07 08:01, 34F
推
06/07 20:44, , 35F
第二大題的第三子問題
06/07 20:44, 35F
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06/07 20:46, , 36F
俺用過脫脂奶粉和脫脂"高鈣"奶粉XD 結果沒差^^
06/07 20:46, 36F
推
06/07 21:26, , 37F
用過期n年的安佳沒+鈣洗完的背景比現在全聯賣的安佳乾淨
06/07 21:26, 37F
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