Re: [求救]一些實驗上的問題

看板Biotech (生命科學)作者leoblack (朋友看太重的猫)時間15年前 (2010/06/07 06:11)推噓2(2推 0噓 5→)

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※ 引述《Imsomniac (小小熱血生科人)》之銘言： : 先自介好了 : 小弟我是大二某生科系的學生最近開始了生科系的實驗室人生~ : 現在老師給我的課題是:cell culture => transfect(GFP) => western blot : 做了半學期後我對於一些實驗原理還不是很明白 : 所以想來求救板上的大大們~ 老實說,其實還蠻擔心這是不是你的作業不過看到很多人的回應,所以就想說獻醜一下但其實這些你應該自己找資料都找得到才對或者在未來的上課中都會學到敝人也是一路到了研究所,才把你的問題分別一點一滴地學起來 : ======================================================================= : 一、作western blot時會用到SDS來使蛋白質依分子量分開，但同時也會讓蛋白質變性。 : 但蛋白質變性後，為何之後的一抗還能辨識目標蛋白質呢? 這問題在你上過生化和免疫學之後,就會懂了,抗原-抗體之間的結合靠得是抗體辨認抗原上的epitope所決定,而所辨認的epitope關鍵可能有: 1.aa的序列(一級結構) 2.conformation 所以~可以知道,能作western blot(WB)的抗體,一定具有辨認特定aa序列的能力, 所以在蛋白質變性後可以辨認得到另外一種就是辨認蛋白質特定的構型,在未變性前,某些aa在空間上靠在一起形成epitope 但在變性後,結構改變,空間上就不在一起,此epitope在蛋白變性後便消失了當然,有些抗體所認的epitope好死不死,不論變性前後,都不受影響亦即,此epitope是特定aa序列,且在native態時就在最外層,可供辨認因此這種抗體就可以同時拿來在WB跟immunocytochemistry (ICC)實驗裡使用 : 二、據我查到的資料，牛奶的目的是block membrane中的孔洞，這是什麼意思?? : 如果沒有做這個步驟，最後的照出來的結果會怎麼樣子(重要我想知道他會長怎樣)? : 還有牛奶不可為加鈣的人工添加牛奶，如果加入了其他東西會怎樣? 有沒有鈣不是最大的重點,最大的重點是"一定要是脫脂奶粉" 我個人是不確定牛奶中鈣的添加是怎麼添加的(ex需要油脂包覆?!) 但~這些添加物都有可能會干擾抗體-抗原的辨識與結合~導致實驗失敗而我學到的說法是,membrane本身就有吸附蛋白質的能力,在你SDS-PAGE上的蛋白 transfer到membrane上時,其實還有很多空隙是沒有蛋白的,若不用牛奶blocking 同樣也是蛋白質的抗體,也會被吸附上去,而要知道WB中,1抗是很珍貴的若你不blocking就直接上1抗,被老闆知道了,即使實驗做得出來,也是會被打死的(笑) : 三、transfect方式選擇? : 我看過很多網路的資料，DEAE-dextran的介紹還蠻少的，是因為現在不常用了嗎? : 還有liposome聽說效率較高，適用的細胞株也比較多對嗎? 他有什麼限制? 我沒用過DEAE-dextran,所以我不懂,可能有待高手解答而說lipo效率高,是同時考量了時間跟金錢來看不過有些細胞用lipo送效率極差(ex A549細胞), 當然,也有其他非lipo系列的的transfection reagent可以使用(ex CaPO4) 否則以我的實驗經驗來看,把質體送入細胞中,送的量最多的應該是電穿孔的方式但是機器貴+條件要抓,且隨著電極管使用次數增加,條件又得重抓,很不方便 : 四、Western blot最後的ECL是怎麼讓蛋白質顯影在底片上的? : 我知道底片是因為電子打在上面，使銀離子沉澱，但是什麼發散電子的? : 顯影劑的作用又是什麼? 為什麼兩個容易加在一起才能使蛋白質顯影? 2抗上會皆有HRP (horseradish peroxidase),在代謝peroxide時,會同時代謝掉substrate 而產生冷光,便可以使底片曝光, 另外,個人不會稱呼那2罐為"顯影劑",這會跟洗底片用的"顯影劑"搞混個人會稱呼為"呈色劑"(雖然他是發光,不是呈色,都亂叫一通~=..=") 你去看ㄧ罐一定是peroxide,另一罐則是substrate 不過,如果你用的是另一套系統,是用AP (Alkaline phosphatase)呈色的話那就又是another story了~不過我沒用過~所以我不知道原理~(可見我沒作過IHC~XDDDDD) : 五、繼代培養中的EDTA是做什麼用的? : 我知道EDTA能除去鈣離子、鎂離子，但為什麼要除去這兩個? : 還有細胞培養時都是用D_PBS(去除鈣離子、鎂離子的PBS)為什麼? : 細胞不需要鈣離子、鎂離子嗎? 讓細胞能貼附的Extracellular matrix (ECM)中,有的需要鈣離子的結合才能作用至於鎂離子,抱歉,恕我學藝不精,我不知道哪個ECM的結合是需要鎂離子的說PBS可以去除,純粹只是因為PBS中沒有Ca2+,以化學角度來說,可以幫助帶走Ca罷了不然去除Ca2+的主力還是在EDTA上,PBS主要是要去除serum跟其他代謝廢物 : ======================================================== : 大概就這些問題了，謝謝大大們解惑。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.62.95.30