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[求救] ligation後 (重做的條件 請各位先進 給 …

看板Biotech (生命科學)作者 (吸鳴)時間14年前 (2010/06/18 00:56), 編輯推噓16(16推 0噓 58→)
留言74則, 11人參與, 最新討論串1/1
各位先進 小弟我有事請教 之前我在做ligation 雖然失敗率很大(失敗率超大 感覺有點在拼運氣= =) 但是最後在培養皿上面 有長出一個菌落 之後 我就用tip挖一點點 在有抗生素的LB大量培養 接著就抽plasmid 我當時跑電泳 只有跑vecter跟ligation後的plasmid 發現這兩條column的band約差了insert的長度 所以我當下就覺得ligation應該有成功 但是我現在想說 用酵素切plasmid應該可以得到vector 與 insert的band 但是不知道味啥 跑電泳 那條cloumn卻是空白 之後 像說用PCR 夾出insert 再跑電泳確認 情況也是一樣 跑出電泳膠片 也是什麼都沒有 連作為模板的plasmid也不見了 現在一整個不知道我那ligation後的plasmid是什麼東西 只知道那plasmid的長度與預期的很像 所以想要請問 各位先進 我這是遇到什麼樣的問題?! 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.8.2.73
推
06/18 01:01, , 1F
跑電泳的vector跟cloned plasmid有切一刀再跑嗎?
06/18 01:01, 1F
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06/18 01:02, , 2F
沒有的話這樣比不準喔
06/18 01:02, 2F
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06/18 01:06, , 3F
可是現在遇到的狀況 是連切兩刀後的產物都不見了@.@"
06/18 01:06, 3F
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06/18 01:06, , 4F
多少DNA下去切?多少U酵素?切多久?總體積?跑膠體積?
06/18 01:06, 4F
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06/18 01:11, , 5F
樓上說的這些會影響嗎? 大量DNA 反應2hr 電泳膠20ml
06/18 01:11, 5F
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06/18 01:12, , 6F
DNA:酵素1:酵素2:buffer:H2O = 5:1:1:1:2
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06/18 01:13, , 7F
loading sample的量5uL
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06/18 01:57, , 8F
有些酵素甘油太多會亂切
06/18 01:57, 8F
推
06/18 03:39, , 9F
太多了 一般酵素來說 只能佔總體積10% 你這明顯20%了
06/18 03:39, 9F
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06/18 03:39, , 10F
請改成5:0.5:0.5:1:3 或是你可以拉大體積改loading量
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06/18 03:40, , 11F
一般RE 酵素 0.5ul所帶的U數絕對可以完全切光一般mini
06/18 03:40, 11F
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06/18 03:41, , 12F
prep出來約5ul體積中的DNA(假設你mini是回溶50or100ul)
06/18 03:41, 12F
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06/18 10:47, , 13F
可是不解的是 我PCR的那條column也都是一條空白
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06/18 10:49, , 14F
連template的band 也都看不見…
06/18 10:49, 14F
推
06/18 10:57, , 15F
我的意思是可能根本沒insert是你被supercoil耍了 所以才
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06/18 10:58, , 16F
要問你有沒有切一刀看看是不是真的plasmid有比vector大
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06/18 10:59, , 17F
這跟切兩刀意思不一樣(特別是你又執著說它有的情況下...)
06/18 10:59, 17F
推
06/18 11:16, , 18F
切一刀是比較準 但是也要看你insert有多大吧
06/18 11:16, 18F
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06/18 11:17, , 19F
PCR的template量跑膠看不到正常吧 加那麼多幹嘛?
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06/18 11:17, , 20F
要是你insert有1k以上 vector也沒有特別巨大
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06/18 11:17, , 21F
那光是看supercoil大概就分得出來
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06/18 11:18, , 22F
PCR template一般加入的量是不會看得出來 不過如果是指
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06/18 11:18, , 23F
單純的template 就要看你template load到gel的量有多少..
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06/18 11:37, , 24F
嗯嗯 我剛剛就去切一刀看看 是不是真的被耍了= =
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06/18 11:39, , 25F
我的insert≒1.5k 現在就看是不是supercoil耍了我 Q_Q
06/18 11:39, 25F
推
06/18 12:14, , 26F
沒切的DNA跑膠沒意義..
06/18 12:14, 26F
推
06/18 16:20, , 27F
新手難免 在練練吧 運氣很重要 基本技術也很要緊
06/18 16:20, 27F
推
06/18 16:48, , 28F
沒切的跑膠並不會沒意義阿 看你vector多大 insert多大
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06/18 16:49, , 29F
例如3k->4.5k 在0.6% gel下其實supercoil就可以分的出來
06/18 16:49, 29F
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06/18 16:49, , 30F
但是要是3k->3.5k 或是9k->12k之類 這就很難分了
06/18 16:49, 30F
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06/18 16:50, , 31F
單純看大小差異跟你跑得gel能給的解析度有關
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06/18 16:51, , 32F
supercoil是會讓他泳動速度變快 但是大的supercoil
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06/18 16:51, , 33F
泳動還是比小的supercoil慢
06/18 16:51, 33F
推
06/18 16:54, , 34F
當然 這只是單純看band shift看有沒有變化而已
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06/18 16:54, , 35F
最準的還是要做RE digest來看 最好可以找出insert特有
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06/18 16:55, , 36F
的RE site來搭配 這樣最好
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推
06/18 19:02, , 37F
有shift不能代表接進去是正確的insert 所以才說沒意
06/18 19:02, 37F
推
06/18 22:03, , 38F
同意樓上,沒切跑膠真的沒意義
06/18 22:03, 38F
推
06/19 00:49, , 39F
B大也沒說錯 這樣直接比的確比較方便 不過當電泳有問題時
06/19 00:49, 39F
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06/19 00:53, , 40F
該一步步檢查 當遇過同一plasmid抽出後跑出不同位置時 就
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06/19 00:55, , 41F
會知道這樣沒比較快..我還遇過有insert的跑出來還比vecto
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06/19 00:56, , 42F
r小的咧...size也不過就大概5k->6k
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06/19 00:59, , 43F
不過我之前沒注意到的是原PO說跑完膠沒任何band 這比較奇
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推
06/19 02:03, , 44F
個人意見直接重作 而且要檢討ligation的實驗條件與步驟
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06/19 02:04, , 45F
只有一顆可挑 切出來又沒東西 成功機率已經不高了
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06/19 02:05, , 46F
建議原PO把construct的設計描述一下 請板上先進幫忙看
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06/19 02:06, , 47F
有時候作cloning檢討不出原因時 直接往前面的步驟重作
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06/19 02:06, , 48F
會比較快點
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06/19 10:35, , 49F
有些地方DNA定量之後比較方便找失敗的原因 只是麻煩一些
06/19 10:35, 49F
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06/19 19:16, , 50F
嗯嗯 謝謝各位的意見 目前 我選擇重做 PCR→切→ligation
06/19 19:16, 50F
目前我的作法是 insert≒ 1.5 kb vector≒ 5.4 kb (1) PCR 1. 95度 2min 2. 95度 30sec ←－ 3. 55度 30sec | 25 cycles 4. 68度 3min30sec －－ 5. 68度 15min 6. 4度 (2) digestion PCR產物 跟vector用 EcoR1與HindIII 切一個小時 digestion condition DNA(vector) = 6 uL / DNA(insert) = 10 uL 10X buffer = 2 uL EcoR1 = 1 uL HindIII = 1 uL DI H2O = 10 uL / DI H2O = 6 uL reaction for 37度 1hr (3) purification kit 純化digestiont產物 電泳 確定有欲得的產物 (目前做到這幕都是OK的) (4) ligation (目前無法完全掌握的一步) insert = 4 uL vector = 4 uL ligase = 1 uL 10X buffer = 1 uL (insert 從膠片上看起來濃於 vector，還是我需要把濃度給訂出來比較好? 再以insert:vector = 5:1 or 3:1 去做ligation ) reaction condition (有三種條件) 1. 4度 overnight 2. 16度 overmight 3. 室溫 1hr transform to competent cell 不知各位先進 小弟有啥需 要改善的地方 謝謝 ※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (06/19 19:43)
推
06/19 22:33, , 51F
純化之後的insert和vector濃度可以測一下
06/19 22:33, 51F
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06/19 22:35, , 52F
提高insert/vector比 16度C overnight試試
06/19 22:35, 52F
推
06/20 00:28, , 53F
感覺你是ligation到轉型那邊有問題～首先請問一下你primer
06/20 00:28, 53F
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06/20 00:28, , 54F
切位有無留幾個mer??如果沒有留直接切的話應該切不動喔
06/20 00:28, 54F
primer的設計 我有考慮到切位要多留幾個mer的問題 所以我在切位前面 有多設計8個mer 用GGG CCC GG 這樣primer的設計應該沒啥太大的問題吧?
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06/20 00:30, , 55F
ligation喔～我好像都沒在管比例的～我都insert弄爆多
06/20 00:30, 55F
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06/20 00:31, , 56F
因為vector感覺比較好得到，我會insert 7, vector 1吧
06/20 00:31, 56F
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06/20 00:32, , 57F
然後如果確定轉型那邊沒問題，但就是ligation有問題
06/20 00:32, 57F
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06/20 00:33, , 58F
看看ligation buffer有沒有問題，因為buffer的ATP如果沒有
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06/20 00:33, , 59F
保存好很容易就壞掉之類的～給你參考囉
06/20 00:33, 59F
推
06/20 09:49, , 60F
跟樓上一樣 我vector都只拿1 insert都塞到爆 4度C o/n
06/20 09:49, 60F
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06/20 09:49, , 61F
ligation buffer看要不要在拿一個新的 確實滿容易壞的
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06/20 09:50, , 62F
畢竟有些人操作習慣不太好 buffer拿了用完也不馬上冰好
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06/20 09:50, , 63F
讓他一直放在室溫 好一點的飄在融化的冰水中...
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06/20 09:51, , 64F
這樣久了以後buffer很容易壞掉
06/20 09:51, 64F
我曾經有考慮過是不是ligation buffer ATP降解的問題 (因為中間 有搬過一次家) 所以我目前用新的 ligase與ligation buffer 可是都還沒有成功 懊惱啊~~ 所以想說請教板上的先進 我是不是作法有問題?! 像我ligation buffer 是在冰上回溶 ATP應該不會太快裂解吧? 用完也馬上冰回20度 冰箱保存 真的感謝版上的先進 能跟小弟我討論 謝謝 ※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (06/20 17:26)
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06/20 20:26, , 65F
我習慣買來就立即分裝buffer 避免反覆解凍結凍
06/20 20:26, 65F
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06/20 20:31, , 66F
切位留8mer對EcoRI和HindIII很夠了 R1我習慣留1mer H3留5mer
06/20 20:31, 66F
推
06/21 08:18, , 67F
你elution是用buffer還是用水？用buffer可能效果會較差
06/21 08:18, 67F
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06/21 08:19, , 68F
再來可以確認一下轉型有無問題～隨便拿個質體試一下
06/21 08:19, 68F
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06/21 12:10, , 69F
嗯嗯 我是用buffer 之前有用過水 但是結果也一樣
06/21 12:10, 69F
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06/21 12:12, , 70F
所以目前 在檢查是不是competent cell沒做好的問題~
06/21 12:12, 70F
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06/24 10:08, , 71F
聽起來像是ligation問題 insert放太多有可能兩條自己就
06/24 10:08, 71F
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06/24 10:12, , 72F
黏回去了 你要不要把你看比例的膠圖show出來看看
06/24 10:12, 72F
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06/24 10:16, , 73F
會長那麼少 大部分ligation問題是主因
06/24 10:16, 73F
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06/24 12:41, , 74F
兩條黏回去?? 是說 兩條insert黏在一起?會有這情形發生??
06/24 12:41, 74F
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