Re: [討論] Membrane protein extraction方法(300P幣)

看板Biotech (生命科學)作者soceress (贏了世界又如何)時間15年前 (2011/01/11 10:27)推噓0(0推 0噓 0→)

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我最近也在收membrane protein 檢體是rat spinal cord 是買Pierce 的mem-per reagent 那組kit 做到最後一個步驟,離心完, 也是分三層, 上層是hydrophilic phase中間是一個很不明顯的interphase 下層是hydrophobic phase (應該跟原po是一樣的分層?) 我要的是最下層的部份它看起來一副就是充滿detergent的樣子 specilaist是跟我說她其他的user收完後直接拿來做western blot 但我照做了,最後看起來也是跟原po的RhoA一樣看說明書上是可以用pierce的某kit透析掉detergent 可是這樣又要買東西了 ^^|| 除了想問跟原po一樣的問題(去除detergent) 還想問問有哪位也用過這組收膜蛋白的kit,之後做western的?? 做出來也會這樣嗎? 要如何解決這樣的問題?? 或是在配running用的檢體時,用PBS或TBS去調整濃度,讓detergent稍微稀釋掉一些?? 謝謝大家~ ※ 引述《waitingu (Phil-Ku)》之銘言： : 最近的實驗必須要看 : non-receptor tyrosine kinase在不同條件下被recruit到membrane的情形 : 閱讀了一些期刊後發現，普遍的做法是用Triton X-100 + sucrose gradient分層 : 此作法通常需要超高速離心 : 但好像也有一種做法是用Triton X-114去做分層，但不需要超高速離心 : (由於老師一直恐嚇說如果超高速離心沒處理好，會提早畢業但沒證書，因此能儘量不用 : 就不用那台老機器)，因此... : 1. 想請問一下，這兩種做法的差異性在哪？ : 2. 如果是Triton X-114這種做法，所看到的分層現象，應該是 : (上層) 水層 (中間)Sucrose cashion (下層)detergent phase : 還是順序有所差別呢？ : 3. 我試了幾次 Triton X-114作法 : 發現可以抽出membrane-associated protein (例如Rho) : 但SDS-PAGE跑出來的band卻會smear(如圖 : http://img545.imageshack.us/f/25531824.jpg/右邊那條) : 推測可能是detergent含量太多，但如果用Acetone沉澱後，蛋白會無法回溶 : 請問版友們對去除detergent步驟是否有好的建議？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.60.122.10